Манипуляция одиночными нервными стволовыми клетками и нейронами в ломтиках мозга с помощью роботизированной микроинъекции
Summary
Этот протокол демонстрирует использование роботизированной платформы для микроинъекции в одиночные нервные стволовые клетки и нейроны в срезах мозга. Этот метод является универсальным и предлагает метод отслеживания клеток в тканях с высоким пространственным разрешением.
Abstract
Центральным вопросом в нейробиологии развития является то, как нервные стволовые клетки и клетки-предшественники образуют мозг. Чтобы ответить на этот вопрос, нужно маркировать, манипулировать и следовать одиночные клетки в ткани мозга с высоким разрешением с течением времени. Эта задача является чрезвычайно сложной из-за сложности тканей в головном мозге. Недавно мы разработали робота, который направляет микроинъекцию иглы в ткани мозга при использовании изображений, полученных из микроскопа для доставки фемтолитера объемы раствора в одиночные клетки. Роботизированная операция увеличивается в результате общей урожайности, которая на порядок больше, чем ручной микроинъекции и позволяет для точной маркировки и гибкой манипуляции одиночных клеток в живой ткани. При этом можно микроинъектность сотни клеток в рамках одного органотипического ломтика. Эта статья демонстрирует использование микроинъекции робота для автоматизированной микроинъекции нейронных клеток-предшественников и нейронов в срезах тканей мозга. В более широком смысле, он может быть использован на любой эпителиальной ткани с изображением поверхности, которые могут быть достигнуты пипеткой. После настройки робот микроинъекции может выполнять 15 или более микроинъекций в минуту. Микроинъекционный робот из-за своей пропускной способности и обратности сделает микроинъекцию широко простой высокой производительности метод манипуляции клеток, которые будут использоваться в биоинженерии, биотехнологии и биофизики для выполнения одноклеточного анализа в органотипических ломтиков мозга.
Introduction
Этот протокол описывает использование робота для таргетинга и манипулирования одиночными клетками в срезах тканей мозга, сосредоточив внимание, в частности, на одиночных нервных стволовых клетках и нейронах. Робот был разработан для решения центрального вопроса в развитии нейробиологии, то есть как нервные стволовые клетки и клетки-предшественникиспособствуют морфогенезу мозга 1,2,3,4,5. Чтобы ответить на этот вопрос, нужно маркировать и отслеживать одиночные нервные стволовые клетки и следовать их прогрессии линии с течением времени, чтобы соотнести поведение одной клетки с морфогенезом тканей. Это может быть достигнуто по-разному, например, путем электропорации ткани мозга в утробе матери или путем маркировки одной клетки с помощью липофильных умирает. Хотя эти методы являются мощными, они не имеют точного разрешения одной клетки (электропорация) и/или возможности манипулировать внутриклеточным пространством (липофилинический краситель). Микроинъекция в одиночные клетки была разработана, чтобы преодолетьэту проблему 6,7,8. Во время микроинъекции, пипетка кратко вставляется в одну клетку в нетронутой ткани под давлением микроинъекции фемтолитера объемовреагентов 9. Ранее мы описали ручную процедуру микроинъекта одиночных нервных стволовых клеток в органотипическойткани (рисунок 1A)10,11. Микроинъекция в нервные стволовые клетки опирается на использование микропипюты, которая вставляется в одиночные нервные стволовые клетки для введения раствора, содержащего флуоресцентный краситель, наряду с другими молекулами, представляющими интерес. Селективное ориентации нервных стволовых клеток достигается путем приближения развивающихся теленцефалона через желудочковой поверхности (или желудочка, см. мультфильм на рисунке 1A), который формируется апической плазменной мембраны апических прародителей (мультфильм на рисунке 1A). Этот процесс должен быть повторен для каждой клетки, что экспериментатор желает ввести. Кроме того, успех микроинъекции зависит от точного контроля глубины и продолжительности инъекций микропипюты в ткани. Таким образом, несмотря на уникальные преимущества, ручная микроинъекция крайне утомительна и требует значительной практики для выполнения при разумной пропускной способности и урожайности, что затрудняет использование этой техники в масштабируемой форме. Чтобы преодолеть это ограничение, мы недавно разработали изображение управляемого робота, Autoinjector12 (или микроинъекции робота), который может автоматически выполнять микроинъекции в одиночные клетки.
Робот микроинъекции использует микроскопические алгоритмы визуализации и компьютерного зрения, чтобы точно ориентироваться на конкретные места в 3-D пространстве в ткани для микроинъекции(рисунок 1B). Робот микроинъекции может быть построен путем внесения относительно простых изменений в существующую установку микроинъекции. Общая схема микроинъекции робота показана на рисунке 1C. Пипетка устанавливается в держатель пипетки, прикрепленный к трехосевому манипулятору. Микроскоп камера используется для получения изображений ткани и микроинъекции иглы. Для контроля давления внутри пипетки используется система регулирования пользовательского давления, а для контроля положения микроинъекторной пипетки используется программируемый микроманипулятор. Изображения камеры ткани и микроинъекции пипетки используются для определения пространственного расположения микроинъекции пипетки кончика и места, в которых микроинъекции должны быть выполнены. Программное обеспечение затем вычисляет траектории, необходимые для перемещения пипетки в ткани. Все оборудование контролируется программным обеспечением, которое мы ранее разработали. Все программное обеспечение написано на языке кодирования (например, Python и Arduino) и может быть загружено https://github.com/bsbrl/Autoinjector с инструкциями. Графический пользовательский интерфейс (GUI) позволяет пользователю изображение ткани и микропипюты, а также настроить траекторию микроинъекции. Наша система может быть создана с использованием относительно простых модификаций перевернутого микроскопа, оснащенного фильтрами яркого поля и эпифлуоресценции.
Во-первых, мы предоставляем инструкции по подготовке ломтиков органотипической ткани мозга для микроинъекции. Затем протокол иллюстрирует запуск микроинъекции робота с последующими подготовительными шагами, такими как калибровка движения пипетки, которые должны быть сделаны до микроинъекции. За этим следует определение параметров впрыска. После этого пользователь может определить траекторию, используемую роботом микроинъекции, и начать процедуру впрыска. Микроинъектируемые ткани (в данном случае ломтики органотипической ткани мозга) могут храниться в культуре в течение разных периодов времени взависимости от экспериментального дизайна 10,11. Ткань может быть обработана, чтобы следить и изучать идентичность и судьбу инъекционных клеток и их потомства. Кроме того, за микроинъектными клетками можно следить с помощью живой визуализации. В рамках этого протокола мы демонстрируем использование робота для автоматического микроинъекции нейронных клеток-предшественников в органотипических ломтиках мыши E14.5 спинного теленцефалона. Робот также способен микроинъекции в новорожденных нейронов в мыши теленцефалона, а также в теленцефалонеплода человека 12.
Таким образом, мы описываем роботизированную платформу, которая может быть использована для следовать и манипулировать одиночными клетками в тканях. Платформа использует давление и, следовательно, чрезвычайно универсальна в отношении химического характера соединения для инъекций. Кроме того, он может быть адаптирован к клеткам-мишеням, кроме стволовых клеток. Мы ожидаем, что наша система будет легко адаптирована к другим модельным системам.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микроинъекция в одиночные нервные стволовые клетки в ткани обеспечивает превосходное разрешение одиночных клеток и по этой причине она была использована для вскрытия клеточной биологии прогрессии нервных стволовыхклеток и перехода судьбы (рисунок 2;см. также 10,11,12). Автоматизированная процедура микроинъекции может быть выполнена на других типах клеток как у эмбриональных мышей, так и у тканей мозга человека. Репрезентативные результаты микроинъекции новорожденных нейронов путем ориентации на базальную поверхность теленцефалона показаны на рисунке 3.
Принцип, установленный здесь, может быть применен к целевой несколько различных типов клеток в эмбриональных мозгах мыши и человеческого мозга. Мы ранее показали, что микроинъекции робот также может быть использован для целевой одиночных клеток-предшественников в мышиного заднего мозга и теленцефалона и новорожденных нейронов в мыши и человека развивающихся neocortex12. Чтобы получить наилучшие результаты процедуры инъекции, следует оптимизировать все шаги перед началом инъекции. Важно тщательно продумать и оптимизировать подготовку жизнеспособных и хорошо сохранившихся органотипических ломтиков тканей из тканей мозга(рисунок 1). Очень важно быть быстрым в процедуре вскрытия и нарезки, иллюстрированной на рисунке 1. Для апической инъекции ориентации APs, следует выбрать ломтики, показывающие идеальную ориентацию апической поверхности. Для инъекций АП идеальной ориентацией является апическая поверхность перпендикулярно нижней части чашки Петри. Любая другая ориентация будет вседозволенной, однако, апическая поверхность перпендикулярно чашке Петри обеспечивает более широкую площадь поверхности для инъекций, тем самым увеличивая успех инъекций. Для инъекций в нейроны, ориентация ломтик играет практически никакого эффекта.
После того, как ломтики для инъекций выбраны, процедура инъекции на срез занимает около 5 минут. Учитывая, что человек работает с живой тканью, настоятельно рекомендуется ускорить процедуру инъекций. С этой целью мы рекомендуем установить все параметры для инъекций через графический интерфейс(рисунок 1D) до того, как ткань будет готова, чтобы уменьшить ненужное время ожидания. Для устранения неполадок, пожалуйста, обратитесь к дополнительному файлу.
В случае долгосрочной культуры ломтика, шаги после автоматизированной процедуры микроинъекции могут повлиять на здоровье клеток и, таким образом, эксперимент. Поэтому настоятельно рекомендуется продать тест на контроль качества и оптимизировать условия культуры среза. Для оценки жизнеспособности клеток после нарезки и инъекции процедуры, мы выполнили EdU маркировки во время культуры, и мы количественно количество пикнотических ядер (прокси для апоптотических клеток) в культурах и вводилиткани 12. Эти количественные оценки не выявили какого-либо существенного влияния микроинъекции на жизнеспособность тканей(рисунок 2C). Мы рекомендуем проводить аналогичные контроль качества при установлении органотипической нарезки тканей и микроинъекции трубопровода в лаборатории.
По сравнению с ручной микроинъекции, микроинъекции робот обеспечивает ряд преимуществ. Во-первых, кривая обучения для пользователя менее крутой по сравнению с ручной инъекции: новый пользователь достигнет высокого уровня знаний после ограниченного числа сессий, как правило, 1 или 2. Во-вторых, в случае ручного микроинъекции сопоставимый уровень знаний требует месяцев обучения. Процедура инъекций быстрее и эффективнее(рисунок 2B). Мы количественно эти параметры и обнаружили, что микроинъекции робот превзошел квалифицированного ручного пользователя по отношению к успеху инъекции (% от успешной инъекции / общее количество инъекций) и в общее количество инъекций наединицу времени 12. Это приводит к общему 300% повышению эффективности инъекций (% от успешной инъекции/мин) для микроинъекции робота по сравнению с квалифицированным пользователем. Повышение эффективности было еще более выраженным при сравнении микроинъекции робота с начинающим пользователем и достигло 700%. И последнее, но не менее последнее, робот микроинъекции может быть легко запрограммирован на систематическое изучение всех пространственных параметров. Это особенно выгодно при адаптации микроинъекции робота к новым клеткам или тканям, или при использовании микроинъекции робота для целей, требующих различного пространственного разрешения.
Создание микроинъекции робота требует минимальных изменений в существующий эпифлуоресцентный микроскоп12. Ранее мы предоставили инструкции по этой адаптации в https://github.com/bsbrl/Autoinjector. После установки оборудования этот протокол предоставляет ключевые методологические детали для успешного проведения автоматизированных микроинъекций. В целом, микроинъекция робот имеет успешную скорость впрыска 15,52 и 2,48 инъекций / мин, что в 15 раз больше, чем неопытный пользователь (1,09 ± 0,67 инъекции / мин), и в 3 раз больше, чем опытный пользователь (4,95 ± 1,05 инъекций / мин)12. Это улучшение успешной скорости инъекций дает возможность как начинающим, так и экспертным пользователям вводить больше клеток в более короткое количество времени, которое имеет важное значение для сохранения жизнеспособности тканей. Кроме того, микроинъекции робот настраивается и траектории, глубина инъекции, количество инъекций, интервал между инъекциями все могут быть настроены с помощью графического интерфейса. Эти функции позволяют использовать микроинъекции робота в качестве инструмента для оптимизации ранее трудоемких экспериментов, а также для изучения принципиально новых экспериментов, которые требуют более высокой урожайности, чем это было возможно ранее.
Основные ограничения процедуры микроинъекции, описанной здесь, связаны с подготовкой ломтиков тканей, что является важным шагом, который требует обширной оптимизации. Кроме того, микроинъекция зависит от наличия поверхности, к ней можно подойти стеклянной пипеткой. Эта функция ограничивает тип тканей и тканей местах, которые могут быть направлены через микроинъекции с помощью нынешней установки.
Микроинъекции робот в настоящее время использует яркие изображения поля и был использован в пробирке мозга ломтик подготовки. В будущем робот микроинъекции может быть объединен с 2-фотонной визуализацией, чтобы увеличить специфичность одноклеточного таргетинга in vivo для молекулярной или красителной маркировки. Такие усилия уже были предприняты для одноклеточной электрофизиологии15,16. Текущее устройство требует ручного наблюдения за процедурой микроинъекции. Будущие версии могут включать в себя стратегии для очистки забиты микроинъекциипипетки 17 или интеграциижидкости обработки роботов 18 для мультиплексных, полностью автономных микроинъекций. Эти устройства могут увеличить масштаб микроинъекции на порядок. Адаптация алгоритмов параллельного контроля нескольких микроинъекциипипеток 19 может позволить мультиплексированную доставку десятков красителей и молекулярных реагентов в те же клетки в рамках тех же экспериментов. Это может открыть новые возможности для молекулярного скрининга в тканях.
Робот микроинъекции может быть использован для метки функционально идентифицированных клеток с помощью ДНК или РНК штрих-кодов. Это, в свою очередь, может быть объединено с другими методами анализа одноклеточных клеток, такими как одноклеточное секвенирование РНК (scRNAseq) и электронная микроскопия. Наши предварительные результаты показывают, что микроинъекции клеток и их потомство могут быть восстановлены и изолированы с помощью диссоциации тканей следуют FACS сортировки (Таверна, неопубликованные результаты). Отсортированные ячейки FACS могут быть использованы для scRNAseq. Кроме того, предварительные результаты показывают, что возможности разрешения одной клетки робота микроинъекции могут быть использованы в сочетании с электронным микроскопическим анализом для изучения клеточной биологии нервных стволовых клеток в тканях с высоким пространственным разрешением (Taverna и Wilsch-Br’uninger, неопубликованные результаты). Эти данные свидетельствуют о том, что микроинъекции робот может быть использован в качестве инструмента для коррелятивного света и электронной микроскопии в тканях и в более широком смысле, для мультимодального анализа идентичности клеток и поведения в тканях.
Микроинъекция опирается на использование давления, и можно позволить себе инъекционные растворы с высокой молекулярной сложностью (например, весь транскриптом). Эта особенность микроинъекции была использована в прошлом для изоляции и клонирования лиганд-закрытых рецепторов20. Вдоль этой линии, микроинъекции робот может быть использован для моделирования и изучения мультигенных черт на клеточном уровне. В сочетании со стратегией суб-пулирования робот микроинъекции также может использоваться в качестве платформы для определения минимального набора генов, вождения определенной черты/клеточного поведения. До сих пор робот микроинъекции использовался для манипулирования биохимией клетки с помощью доставки мРНК, ДНК или рекомбинантныхбелков 10,21,22. Мы предвидим применение микроинъекционного робота для зондирования биофизики внутриклеточного пространства, например, путем доставки наноматериалов или наномашин, позволяющих зондировать и/или манипулировать биофизическими свойствами внутриклеточного пространства.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить Фонд Номиса (ET). СБК признает средства департамента машиностроения, Колледж науки и техники, MnDRIVE RSAM инициативе Университета Миннесоты, Миннесота департамент высшего образования, Национальные институты здравоохранения (NIH) 1R21NS103098-01, 1R01NS111028, 1R34NS11654, 1R21NS112886 и 1R21 NS111196. GS была поддержана Национальным научным фондом Высшей научно-исследовательской стипендии и NSF IGERT учебный грант.
Materials
| Chemicals | |||
| Agarose, Low Melt | Carl Roth | Cat# 6351.2 | |
| Agarose, Wild Range | Sigma-Aldrich | Cat# A2790 | |
| Best-CA 221 Glue | Best Klebstoffe GmbH & Co.KG | Cat# CA221-10ml | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | Cat# 17504044 | |
| Cellmatrix Type-IA (Collagen, Type !) | FUJIFILM Wako Chemicals | Cat# 637-00653 | |
| Distilled Water | |||
| DMEM-F12, CO2 independent (w/o Phenol red) | Sigma-Aldrich | Cat# D2906 | |
| DMEM-F12, CO2 independent (with Phenol red) | Sigma-Aldrich | Cat# D8900 | |
| HEPES-NAOH, pH 7.2, 1M (HEPES buffer) | Carl Roth | Cat# 9105.3 | |
| L-Glutamine, 200 mM | Thermo Fisher Sientific | Cat# 25030024 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | Cat# 81381 | |
| N-2 Supplement | Thermo Fisher Scientific | Cat# 17502048 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | Cat# 21103049 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | Cat# AM9937 | |
| O2 (40%), CO2 (5%), N2 (55%) Mix, 50 liters | |||
| Paraformaldehyde | Merck | Cat# 818715 | |
| PBS | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15140122 | |
| Rat serum | Charles River Laboratories | ||
| Japan | |||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | Cat# 106323 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | Cat# 106482 | |
| Tyrode’s salt | Sigma | Cat# T2145-10x1L) | |
| Equipment | |||
| Borosilicate glass capillaries, 1.2 mm outer diameter x 0.94 mm inner diameter | Sutter Instruments | Cat# BF-120-94-10 | |
| Bottle-top filter system, 500 mL | Corning | Cat# 430769 | |
| Computer PC | |||
| Custom pressure rig | Custom pressure rig | ||
| Electronic pressure regulator | Parker Hannifin | Cat# 990-005101-002 | |
| Falcon tubes, 15 mL | Corning | Cat# 430791 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Corning | Cat# 430829 | |
| Fine-tip paintbrush | |||
| Flaming/ Brown micropipette puller | Sutter Instruments | Cat# P-97 | |
| Forceps, Dumont no. 3 | Fine Science Tools | Cat# 11231-30 | |
| Forceps, Dumont no. 5 | Fine Science Tools | Cat# 11255-20 | |
| Forceps, Dumont no. 55 | Fine Science Tools | Cat# 11252-20 | |
| Heating block | Labtech International | Cat # Dri block Digi2 | |
| Inverted fluorescence microscope | Zeiss | Cat# Axiovert 200 | |
| Light source | Olympus | Cat# Highlight 3100 | |
| Manual pressure regulator | McMaster Carr | Cat# 0-60 PSI 41795K3 | |
| Microloader Tips | Eppendorf | Cat# 5242956.003 | |
| Microcontroller | Arduino | Cat# Arduino Due | |
| Microscope camera Hamamatsu Orca Flash 4.0 V3 | |||
| Motorized stage XY for microscope | |||
| Multiwell plate, 24 wells | Nunc | Cat# 142475 | |
| Pasteur pipettes, plastic | |||
| Petri dish, 60 x 15 mm | Greiner | Cat# 628102 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Nunc | Cat# 153066 | |
| Petri dish, 34 x 14 mm, including Microwell no. 1.5 cover glass | MatTek | Cat# P35G-1.5-14-C | |
| Pipette holder | Warner Instruments | Cat# 64-2354 MP-s12u | |
| Pipette and tips | |||
| Puller filament, 3.0-mm square box filament | Sutter Instrument | Cat# FB330B | |
| Slice culture incubation box | MPI-CBG | Cat# custom made | |
| Solenoid valve | Cat# LHDA053321H-A | ||
| Stereomicroscope | Olympus | Cat# SZX12 | |
| Tabletop centrifuge | Heraeus | Cat# 5431622 | |
| Thermometer | |||
| Three-axis Manipulator | Sensapex Inc | Cat# tree-axis uMP | |
| Vibratome | Leica | Cat# VT1000s | |
| Whole-embryo-culture-system incubator | Ikemoto Company | Cat# RKI-10-0310 | |
| Waterbath | |||
| Software and Algorithms | |||
| Arduino | Arduino | ||
| Fiji | RRID: SCR_002285 | ||
| Python | Python Software foundation | Python 2.7.12 | |
| ZEN | RRID: SCR_013672 |
References
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 465-502 (2014).
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (10), 777-788 (2005).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesisin a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Developmental Cell. 38 (6), 590-600 (2016).
- Pepperkok, R. et al. Automatic microinjection system facilitates detection of growth inhibitory mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (18), 6748-6752 (1988).
- Pepperkok, R., Lowe, M., Burke, B., Kreis, T. E. Three distinct steps in transport of vesicular stomatitis virus glycoprotein from the ER to the cell surface in vivo with differential sensitivities to GTPγS. Journal of Cell Science. 111 (13), 1877-1888 (1998).
- Pepperkok, R. et al. β-COP is essential for biosynthetic membrane transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi complex in vivo. Cell. 74 (1), 71-82 (1993).
- Ansorge, W., Pepperkok, R. Performance of an automated system for capillary microinjection into living cells. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 16 (4), 283-292 (1988).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neuroscience. 15 (2), 329-337 (2012).
- Wong, F. K., Haffner, C., Huttner, W. B., Taverna, E. Microinjection of membrane-impermeable molecules into single neural stem cells in brain tissue. Nature Protocols. 9 (5), 1170-1182 (2014).
- Shull, G., Haffner, C., Huttner, W. B., Kodandaramaiah, S. B., Taverna, E. Robotic platform for microinjection into single cells in brain tissue. EMBO Reports. 20 (10), e47880 (2019).
- Jabeen, S., Thirumalai, V. The interplay between electrical and chemical synaptogenesis. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1914-1922 (2018).
- Nagy, J. I., Pereda, A. E., Rash, J. E. Electrical synapses in mammalian CNS: Past eras, present focus and future directions. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1860 (1), 102-123 (2018).
- Suk, H.J. et al. Closed-loop real-time imaging enables fully automated cell-targeted patch-clamp neural recording in vivo. Neuron. 95 (5), 1037-1047 (2017).
- Annecchino, L. A. et al. Robotic automation of in vivo two-photon targeted whole-cell patch-clamp electrophysiology. Neuron. 95 (5), 1048-1055 (2017).
- Kolb, I. et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Scientific Reports. 6, 35001 (2016).
- Holst, G. L. et al. Autonomous patch-clamp robot for functional characterization of neurons in vivo: development and application to mouse visual cortex. Journal of Neurophysiology. 121 (6), 2341-2357 (2019).
- Kodandaramaiah, S. B. et al. Multi-neuron intracellular recording 1 in vivo via interacting autopatching 2 robots. ELife. 7, 24656 (2018).
- Lubbert, H. et al. cDNA cloning of a serotonin 5-HT1c receptor by electrophysiological assays of mRNA-injected Xenopus oocytes (RNA fractionation/hybrid depletion/hybrid selection/choroid plexus/voltage clamp). Neurobiology. 84 (2) 4332-4336 (1987).
- Florio, M. et al. Human-specific gene ARHGAP11B promotes basal progenitor amplification and neocortex expansion. Science. 347 (6229), 1465-1470 (2015).
- Kalebic, N. et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
