ロボットマイクロインジェクションを用いた脳スライスにおける単一神経幹細胞とニューロンの操作

すべての動物研究はドイツの動物福祉法に従って行われ、必要なライセンスはドイツのドレスデンの動物実験のための地域倫理委員会(Tierversuchskommission、Landesdirektionドレスデン)から取得されました。Organotypicスライスは、E14.5またはE16.5 C57BL/6マウス胚性テレンセファロン(Janvier Labs)から調製した。 1. ソフトウェアのインストール 指示に従って、https://github.com/bsbrl/Autoinjectorからソフトウェアをインストールします。 2. 試薬・ピペットの製造 アガロース:2つの別々の200 mLガラス瓶に100mLの細胞培養グレードPBSの3gの広い範囲のアガロースと3gの低融点アガロースの3gを別々に溶解することによって3%のアガロースを調製する。室温で3ヶ月まで保管してください。 タイローデ溶液:重炭酸ナトリウムとタイローデの塩1g(ボトル全体の含有量を使用)、1Lの蒸留水に1M HEPESの13 mLを溶解します。pH を 7.4 に調整します。0.2 μmのボトルトップフィルターで溶液をフィルターします。 スライス培地(SCM):ラット血清10mL、2mMグルタミン1mL、ペニシリンストレプトマイシン100x、N-2サプリメント1mL(100x)、B27サプリメント(50x)2mL(50x)、HEPES1mL(pH 7.3)バッファーを84mLの神経バザルに加える。アリコート 5 mL の SCM を 15 mL チューブにします。-20°Cで保管してください。 CO2-独立マイクロインジェクション培地(CIMM):蒸留水200mLで粉末を溶解して、5倍DMEM改質低グルコース溶液(フェノールレッドなし)を調製します。0.2 μmのボトルトップフィルターを通したフィルターソリューション(DMEMパウダーの場合は、ボトル全体の内容を使用)。CIMMの100 mLを調製するために、5x DMEM改変溶液の20 mL、1 mLのHEPESバッファー、1mLのN2サプリメント(100x)、B27サプリメント(50x)の2mL、ペニシリン・ストレプトマイシン1mL(100x)、2mLの2mL、74mLの蒸留水を混合する。溶液を4°Cで保存してください。 再構成バッファー: 262 mM NaHCO 3,0.05N NaOH, 200 mM HEPES を蒸留水に溶解して再構成バッファーを準備します。ボトルトップ0.22 μmフィルターシステムを通して滅菌ガラスボトルに入り、溶液を殺菌します。アリコート500 μLの再構成バッファーを気密マイクロ遠心チューブに入れます。4 °Cで保管。 マイクロインジェクション染料ストック:蛍光標識されたデキストランをRNaseフリー蒸留水(最終濃度10μg/μL)に溶解します。5 μLのアリコートを準備し、使用するまで-20°Cで保管してください。 マイクロピペットプーラーを使用して、ホウケイ酸ガラスキャピラリー(1.2 mm外径、0.94mm内径)からマイクロインジェクションピペットを引き出します。ピペットをほこりから守ります。ピペットは2~3日以上保管しないでください。この実験では、引っ張りパラメータは HEAT: ランプ温度 +1 – 5;プル: 100;VEL: 110;デル: 100.HEATとVELは、ピペットの最も形状とサイズに影響を与えるパラメータです。注:最適なマイクロインジェクションピペットは、マイクロインジェクション中の細胞損傷を避けるために、長くて柔軟なチップを備えています。 3. ティッシュスライスの準備 脳組織解剖の前に電子レンジを使用して3%広域アガロースを溶融します。埋め込む前に37°Cの水浴に保管してアガロースを固めないでください。ピペットがほこりから保護されていることを確認します。ピペットは2~3日以上保管しないでください。 SCMのアリコートを解凍し、水浴を使用して37 °Cにタイロードの溶液の10 – 12 mL CIMMと20 mLを温めます。 蛍光トレーサー(Dextran-3000またはDextran-10000-Alexa共役;最終濃度5~10μg/μL)を、他の化学薬品と混ぜ合わせます。マイクロインジェクション溶液を16,000xgで4°Cで30分間遠心分離する。 上清を収集し、新しいチューブに転送します。マイクロインジェクション溶液を使用するまで氷の上に保管してください。 E13.5 – E16.5マウス胚の頭部を使用して、テレンセファロンの組織組織スライスを準備します。皮膚を取り除き、鉗子を使用して頭蓋骨を開き、正中線に沿って移動します。開いた頭蓋骨から胚性脳を解剖し、脳の腹側から始まる脳組織を覆う髄液を取り除く。解剖した全脳をタイローデの溶液中に37°Cの加熱ブロックに残します。注: 3.4 で説明されているすべての解剖手順は、事前にウォームされた Tyrode のソリューションで実行する必要があります。 広い範囲の溶融アガロースを使い捨て埋め込み型に注ぎます。アガロースを38~39°Cに冷却すると、パスツールピペットを使用して脳(最大4個)を慎重に移します。このステップでは、常にカットヒントを使用してください。 組織に触れることなく、ヘラまたはデュモン#1鉗子を使用して、組織の周りにアガロースをかき混ぜます。アガロースを室温で固めます。アガロースが固まったら、組織を取り巻く過剰なアガロースをトリミングする。 バッファトレイにPBSを入れます。トレイに垂直な組織のロストロ・カウダル軸で脳を向けます(嗅球のランドマークとして使用し、脳の最もrostral -部分を表します)。ビブラートを使用して250μmのスライスをカットします。 3.5cmのペトリ皿に2mLのプリウォームドメディアを入れます。プラスチック製のパスツールピペットを使用して、この皿にスライス(10 – 15)を転送します。一度完了したら、スライスでペトリ皿をスライス培養器にシフトします。40%O2/5%CO2/55%N2を含む加湿雰囲気で37°Cでスライスを保持します。 4. マイクロインジェクション コンピュータ、顕微鏡、顕微鏡カメラ、マニピュレータ、圧力リグ、圧力センサーの電源を入れます。GitHub からダウンロードしたメインフォルダにあるファイル”launchapp.py”をクリックしてアプリケーションをロードし、ポップアップ画面でデバイス設定を指定します (インストール手順については、手順 1.1 を参照)。 ピペットを溶液に浸す前に、不要な詰まりを防ぐために外向きの圧力を作成します。ピペットに圧力を加える場合は、 補償圧力 バーを 24 ~ 45% にスライドさせて、[ 値の設定] をクリックします。次に、圧力センサで示される 1 – 2 PSI (69 – 138 mbar) に機械的圧力バルブノブを回して、十分な圧力に圧力を調整します。 2 mLの事前温めたCIMMを含む3.5cmのペトリ皿にスライスを移します。ペトリ皿の中央にマイクロインジェクションするスライスを置きます。ペトリ皿を予熱(37°C)マイクロインジェクション段階に移します。 マイクロインジェクションピペットに1.4 -1.6 μLのマイクロインジェクション溶液(ステップ3.3から)を長チップのプラスチックピペットを使用してロードします。マイクロインジェクションピペットをピペットホルダーに挿入します。 顕微鏡で最も低い倍率を使用して、スライスを焦点に持ち込み、マイクロピペットをこの視野(FOV)に導き、スライスターゲットと同じ平面に焦点を合わせます。アプリケーションでFOVを確認するために、カメラに顕微鏡の出力を切り替えます。 インターフェイスの左上にある拡大ボタンをクリックして、デバイスのキャリブレーションを開始します。ウィンドウは倍率を選択するように求められます。10倍の倍率を選択するか、レンズが設定されている倍率(例えば、4x、10x、20x、40x)を選択し 、OKを押します。ソフトウェアは、内部対物レンズが10倍(最も一般的な対物レンズの倍率)であると仮定します。 顕微鏡のマイクロメトリックホイールを使用してピペットチップを再び焦点を合わせ、カーソルでピペットチップをクリックします。次に、ステップ1.1ボタンを押し、ポップアップウィンドウでOKを押します。ピペットはY方向に移動します。ピペットの先端をクリックし、ステップ1.2ボタンを押します。最後に、ピペットの角度ボックスに45と入力し、設定角度を押します。 必要なパラメータを [自動マイクロインジェクションコントロール ]パネルに入力します。素端な前駆体へのマイクロインジェクションでは、射出距離を20~40μm、深さを10~15μmに設定します。ニューロンへのマイクロインジェクションの場合、基礎側からの射出距離は30~40μm、深さはターゲットに設定されている内容に応じて10~30μmに設定されます。常に速度を 100% に設定します。[ 値の設定]をクリックします。注:アプローチ距離はピペットが次の注入距離に移動する前に組織から引き出す距離であり、深さはマイクロインジェクションが行く組織への深さであり、間隔は順次注入の間の線に沿った距離であり、速度はμm/sのピペットの速度である。 [ エッジの描画 ]ボタンをクリックし、ポップアップ ウィンドウで目的の軌道に沿ってカーソルをドラッグして、射出の軌道を定義します。前駆細胞をマイクロ注入する場合、テレンスファロン表面の腹側は 図2Aに示すように標的とする。ピペットをラインの先頭に持ってきて、ピペットの先端をクリックします。マイクロインジェクトを開始するには 、[軌道を実行 ]をクリックします。このステップを、対象とする射出の各平面に対して繰り返します(通常、1面あたり40-75回の注射を行う3~4機で行われます)。 5. 免疫蛍光のための組織培養と組織スライス処理 コラーゲン混合物(1.5mg/mL)を調製する:チューブにマトリックス溶液1.25mL、蒸留水0.5mL、5x DMEM-F12溶液の0.5 mL、再構成バッファー0.25 mLを加えます。使用するまで氷の上に保管してください。 スライス培養インキュベーションチャンバーからマイクロ注入スライスを含むペトリ皿を入手し、そのスライスをコラーゲン混合物に浸漬します。 200 ~ 300 μL のコラーゲン混合物と共に、35 mm のガラス底皿の 14 mm ウェルにスライスを移します。スライスが非常に少ないコラーゲンで覆われていることを確認してください。このセットアップは、栄養素と酸素の取り込みに最適な条件を可能にします。 2 組の鉗子を使用してスライス間に十分なスペースがあることを確認しながら、スライスの方向を設定します。加熱ブロックを使用してペトリ皿を37°Cで5分間インキュベートし、コラーゲンを固化させる。この時間をスライスカルチャの t = 0 と考えてください。 ペトリ皿をスライス培養器に戻し、さらに40分間移動します。その後、2 mLの温め込み SCM を加えます。スライスは、所望のタイムポイントまでカルチャに保持されます。 スライス培養インキュベーターからスライスを取り出し、SCMを吸引します。コラーゲン埋め込みスライスを1倍のPBSで洗います。4%(wt/vol)パラホルムアルデヒド(120 mMリン酸緩衝液、pH 7.4)を加え、30分間RTに組織を残します。その後、一晩固定できるように4°Cに移動します。 翌日パラホルムアルデヒド溶液を吸引し、1xPBSを行う。コラーゲンからスライスを取り除くために、2組の鉗子を使用して、実体顕微鏡下でスライスを穏やかに抽出します。 マイクロ注入スライスを処理するために3%(wt/vol)低融点アガロースを溶融するためにマイクロ波を使用してください。溶けたアガロースを使い捨ての埋め込み型に注ぎ、38~39 °C程度に冷却します。 プラスチック製のパスツールピペットを使用して、低融解アガロースを含むこの金型にステップ5.7から組織スライスを移します。スライスのパイル側が上にあり、心室表面が下向きになっていることを確認します。必要に応じてそれに応じてオリエント。アガロースをRTに冷まして固めましょう。 スライスを囲む余分なアガローズをトリミングします。アガロースブロックの向きを変えて、カット面がビブラートメの切断ブレードと平行になるようにします。ビブラートメを使用して、50 μmの厚いセクションをカットします。 24の井戸皿に1x PBSを入れます。細かい先端のペイントブラシを使用して、この皿にセクションを転送します。標準プロトコルに従って免疫蛍光を行います。