Manipulatie van enkele neurale stamcellen en neuronen in hersenschijfjes met behulp van roboticamicroïsjectie

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse wetgeving inzake dierenwelzijn, en de nodige vergunningen werden verkregen van de regionale Ethische Commissie voor Dierproeven van Dresden, Duitsland (Tierversuchskommission, Landesdirektion Dresden). Organotypic plakjes werden bereid van E14.5 of E16.5 C57BL/6 muis embryonale telencephalon (Janvier Labs). 1. Installatie van software Volg instructies om de software van https://github.com/bsbrl/Autoinjector te installeren. 2. Bereiding van reagentia en pipetten Agarose: Bereid 3% agarose door afzonderlijk oplossen van 3 g van breed scala agarose en 3 g laag-smeltpunt agarose in 100 mL van cel cultuur-grade PBS in twee afzonderlijke 200 mL glazen flessen, respectievelijk. Bewaar maximaal 3 maanden op kamertemperatuur. Tyrode-oplossing: Los 1 g natriumbicarbonaat en Tyrodes zout op (gebruik het gehalte aan de gehele fles) en 13 mL van 1 M HEPES in 1 L gedestilleerd water. Pas de pH aan op 7,4. Filter de oplossing door een 0,2 μm flestopfilter. Slice kweekmedium (SCM): Voeg 10 mL rattenserum toe, 1 mL van 2 mM glutamine, 1 mL penicilline-streptomycine (100x), 1 mL N-2 supplement (100x), 2 mL B27 supplement (50x) en 1 mL HEPES (pH 7.3) buffer in 84 mL neurobasal medium. Aliquot 5 mL SCM in 15 mL buizen. Bewaar bij -20 °C. CO2-IndependentMicroinjection Medium (CIMM): Bereid 5x DMEM gemodificeerde low-glucose oplossing (zonder fenol rood) door het oplossen van het poeder in 200 mL gedestilleerd water. Filteroplossing door een 0,2 μm bottle-top filter (gebruik voor het DMEM poeder de inhoud van de gehele fles). Om 100 mL CIMM voor te bereiden, meng 20 mL 5x DMEM gemodificeerde oplossing, 1 mL HEPES buffer, 1 mL N2 supplement (100x), 2 mL B27 supplement (50x), 1 mL penicilline-streptomycine (100x), 1 mL van 2 m glutamine en 74 mL gedestilleerd water. Bewaar de oplossing op 4 °C. Reconstitutiebuffer: Bereid de reconstitutiebuffer voor door 262 mM NaHCO3, 0,05 N NaOH, 200 mM HEPES in gedestilleerd water op te lossen. Steriliseer de oplossing door filtratie door middel van een fles-top 0,22 μm filtersysteem in een steriele glazen fles. Aliquot 500 μL reconstitution buffer in luchtdichte microcentrifuge buizen. Bewaar bij 4 °C. Microinjectie kleurstof voorraad: Los de fluorescerende gelabeld Dextran in RNase vrij gedestilleerd water (uiteindelijke concentratie 10 μg/μL). Bereid 5 μL aliquots voor en bewaar bij -20 °C tot gebruik. Trek de micro-injectiepipetten uit borosilicaatglazen haarvaten (1,2 mm buitendiameter, binnendiameter van 0,94 mm) met behulp van de micropipettrekker. Bescherm de pipetten tegen stof. Bewaar pipetten niet langer dan 2 – 3 dagen. Voor dit experiment waren de trekparameters HEAT: hellingstemperatuur +1 – 5; PULL: 100; VEL: 110; DEL: 100. HEAT en VEL zijn de parameters die de meeste vorm en grootte van de pipet beïnvloeden.LET OP: De optimale microinjectiepipet heeft een lange en flexibele punt, om celschade tijdens microinjectie te voorkomen. 3. Preparaat van weefselschijf Smelt de 3% breed scala agarose met behulp van een magnetron voorafgaand aan de hersenweefsel dissectie. Laat de agarose niet stollen door in een waterbad op 37 °C te blijven voordat u inbedding krijgt. Zorg ervoor dat de pipetten beschermd zijn tegen stof. Bewaar pipetten niet langer dan 2 – 3 dagen. Ontdooi een aliquot van SCM en warm 10 – 12 mL CIMM en 20 mL van Tyrode’s oplossing tot 37 °C met behulp van een waterbad. Meng de fluorescerende tracer (Dextran-3000 of Dextran-10000-Alexa vervoegt; eindconcentratie 5 – 10 μg/μL) met de andere chemische(s) die moet worden geïnjecteerd. Centrifugeer de microinjectieoplossing op 16, 000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Verzamel de supernatant en breng over in een nieuwe buis. Houd de microinjectieoplossing op ijs tot gebruik. Gebruik de hoofden van E13.5 – E16.5 muisembryo’s om organotypische weefselplakken van de telencephalon voor te bereiden. Verwijder de huid en open de schedel met behulp van de tang, bewegen langs de middellijn. Ontleden de embryonale hersenen uit de open schedel en verwijder de hersenvliezen die het hersenweefsel vanaf de ventrale kant van de hersenen. Laat het ontleede hele brein in Tyrode’s oplossing op een 37 °C verwarmingsblok.OPMERKING: Alle in punt 3.4 beschreven dissectiestappen moeten worden uitgevoerd in de oplossing van voorgewarmd Tyrode. Giet het brede scala gesmolten agarose in een wegwerp inbedding schimmel. Wanneer de agarose wordt gekoeld tot 38 – 39 °C, breng je de hersenen (maximaal 4) er voorzichtig in met behulp van een Pasteur pipet. Gebruik altijd cut tips voor deze stap. Roer de agarose rond het weefsel, hetzij met behulp van een spatel of een paar Dumont #1 tangen zonder het weefsel aan te raken. Laat de agarose stollen bij kamertemperatuur. Zodra de agarose is gestold, trim de overtollige agarose rond het weefsel. Vul de bufferlade met PBS. Oriënteer de hersenen met de rostro-caudal as van het weefsel loodrecht op de lade (gebruik als oriëntatiepunt de reukbollen, die het rostral-grootste deel van de hersenen vertegenwoordigen). Snijd 250 μm plakjes met behulp van een vibratome. Vul een petrischaaltje van 3,5 cm met 2 mL voorverwarmde media. Met behulp van een plastic Pasteur pipet, breng plakjes (10 – 15) naar dit gerecht. Eenmaal gedaan, verschuif de petrischaal met de plakjes in de slice cultuur incubator. Houd de plakjes op 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 40% O2 / 5% CO2 / 55% N2 tot gebruik. 4. Microinjectie Zet de computer, microscoop, microscoop camera, manipulators, druk tuig, en druksensor. Laad de toepassing door op het bestand” launchapp.py” te klikken in de hoofdmap die is gedownload van GitHub en geef de apparaatinstellingen op in het pop-upscherm (zie stap 1.1 voor installatie-instructies). Maak een uitgaande druk om ongewenste verstopping te voorkomen voordat u de pipet in de oplossing dompelt. Als u druk wilt uitoefenen op de pipet, schuift u de compensatiedrukbalk naar 24 – 45% en klikt u op Waarden instellen. Stem vervolgens de druk af op voldoende druk door de mechanische drukklepknop op 1 – 2 PSI (69 – 138 mbar) te draaien, zoals aangegeven door de druksensor. Breng de plakjes over op een petrischaal van 3,5 cm met 2 mL voorverwarmde CIMM. Plaats de te microïnjecte plakjes in het midden van de petrischaal. Breng de petrischaal naar de voorverwarmde microinjectiefase (37 °C). Laad de microinjectiepipet met 1,4 –1,6 μL microinjected solution (vanaf stap 3.3) met behulp van een plastic pipet met lange puntjes. Plaats de microinjectiepipet op de pipethouder. Met behulp van de laagste vergroting op de microscoop, breng het segment in focus en begeleiden de micropipet naar dit gezichtsveld (FOV), zodat het is gericht op hetzelfde vlak als de slice doel. Schakel de uitgang van de microscoop naar de camera om de FOV in de toepassing te zien. Klik op de vergrotingsknop linksboven in de interface om apparaatkalibratie te starten. Een venster vraagt om de vergroting te selecteren. Selecteer de 10x vergroting, of welke vergroting de lens is ingesteld op (bijvoorbeeld 4x, 10x, 20x, 40x) en druk op Ok. De software gaat ervan uit dat de interne objectieve lens is 10x (de meest voorkomende objectieve lens vergroting). Richt de pipetpunt opnieuw met behulp van het micrometrische wiel van de microscoop en klik met de cursor op de pipetpunt. Druk vervolgens op de knop stap 1.1 en druk op OK in het pop-upvenster. De pipet beweegt in de Y-richting. Klik op de punt van de pipet en druk op de stap 1.2 knop. Voer ten slotte 45 in de pipettehoekkast en druk op de instelhoek. Voer de gewenste parameters in het paneel Automatische microinjectiebesturingselementen in. Voor micro-injectie in apicale voorlopers stelt u de injectieafstand in op 20 – 40 μm en diepte op 10 – 15 μm. Voor microinjectie in neuronen stel de injectieafstand 30 – 40 μm van de basale kant, en diepte tot 10 – 30 μm, afhankelijk van wat wordt gericht. Stel de snelheid altijd in op 100%. Klik op Waarden instellen.OPMERKING: De naderingsafstand is de afstand die de pipet uit het weefsel trekt voordat hij naar de volgende injectieafstand gaat, diepte is de diepte in het weefsel dat de microinjectie gaat, afstand is de afstand langs de lijn tussen sequentiële injecties, snelheid is de snelheid van de pipet in μm/s. Klik op de knop Rand tekenen en sleep de cursor langs de gewenste baan in het pop-upvenster om de baan van de injectie te definiëren. Voor microinjecterende voorloperstamcellen is de ventrale zijde van het telencephalonoppervlak gericht, zoals blijkt uit figuur 2A. Breng de pipet naar het begin van de lijn en klik op de punt van de pipet. Klik op Traject uitvoeren om te beginnen met microinjecteren. Herhaal deze stap voor elk vliegtuig van injectie gericht (meestal gedaan voor 3 – 4 vliegtuigen met 40 – 75 injecties per vliegtuig). 5. Weefselkweek en weefselschijfverwerking voor immunofluorescentie Bereid het collageenmengsel (1,5 mg/mL): Voeg aan een buis 1,25 mL van de matrixoplossing, 0,5 mL gedestilleerd water, 0,5 mL 5x DMEM-F12-oplossing en 0,25 mL reconstitutiebuffer toe. Houd het op ijs tot gebruik. Verkrijg de petrischaal met de microinjected plakjes uit de segmentcultuur incubatiekamer en dompel de plakjes onder in het collageenmengsel. Breng de plakjes samen met 200 – 300 μL collageenmengsel over in een 14 mm put van een schotel met glazen bodem van 35 mm. Zorg ervoor dat de plakjes zijn bedekt met zeer minder collageen. Deze opstelling zorgt voor de optimale omstandigheden voor voedingsstoffen en zuurstofopname. Oriënteer de segmenten en zorg ervoor dat er voldoende ruimte is tussen de segmenten met behulp van twee paar tangen. Broed de petrischaal 5 min bij 37 °C uit met behulp van een verwarmingsblok om het collageen te laten stollen. Beschouw deze tijd als t = 0 van slice cultuur. Verplaats de petrischaal terug naar de slice cultuur incubator voor nog eens 40 minuten. Voeg vervolgens 2 mL van de voorverwarmde SCM toe. Plakjes worden bewaard in de cultuur tot het gewenste tijdstip. Haal de plakjes uit de slice cultuur incubator en aspirate de SCM. Was de collageen-ingebedde plakjes met 1x PBS. Voeg 4% (wt/vol) paraformaldehyde (in 120 mM fosfaatbuffer, pH 7.4) toe en laat het weefsel 30 minuten in RT liggen. Verplaats het vervolgens naar 4 °C om ‘s nachts fixatie mogelijk te maken. Aspirate de paraformaldehyde oplossing de volgende dag en uit te voeren 1x PBS wasbeurten. Als u de plakjes uit het collageen wilt verwijderen, gebruikt u twee paar tangen om de plakjes onder een stereomicroscoop voorzichtig te extraheren. Gebruik een magnetron om de 3% (wt / vol) laag smeltpunt agarose smelten voor de verwerking van de microinjected plakjes. Giet de gesmolten agarose in een wegwerp inbeddingsvorm en laat het afkoelen tot ongeveer 38 – 39 °C. Breng de weefselplakjes van stap 5.7 in deze mal met een laag smeltende agarose met behulp van een plastic Pasteur pipet. Zorg ervoor dat de pialzijde van het segment omhoog is en dat het ventriculaire oppervlak naar beneden kijkt. Indien nodig oriënteren dienovereenkomstig. Laat de agarose afkoelen tot RT om te stollen. Trim de extra agarose rond de plakjes. Oriënteer het agaroseblok om ervoor te zorgen dat het snijoppervlak parallel loopt met het snijblad van de vibratome. Snijd met vibratome 50 μm dikke delen. Vul een 24 put schotel met 1x PBS. Breng de secties in deze schotel met behulp van een fine-tip penseel. Immunofluorescentie uitvoeren volgens de standaardprotocollen.