التلاعب بالخلايا الجذعية العصبية والخلايا العصبية في شرائح الدماغ باستخدام الحقن المجهري الروبوتي
Summary
يوضح هذا البروتوكول استخدام منصة روبوتية للدمج المجهري في الخلايا الجذعية العصبية والخلايا العصبية في شرائح الدماغ. هذه التقنية متعددة الاستخدامات وتوفر طريقة لتتبع الخلايا في الأنسجة ذات الدقة المكانية العالية.
Abstract
سؤال مركزي في علم الأعصاب التنموي هو كيف تشكل الخلايا الجذعية والنسل العصبية الدماغ. للإجابة على هذا السؤال، يحتاج المرء إلى تسمية، والتلاعب، واتباع الخلايا الفردية في أنسجة الدماغ مع ارتفاع القرار مع مرور الوقت. هذه المهمة صعبة للغاية بسبب تعقيد الأنسجة في الدماغ. لقد طورنا مؤخرا الروبوت، التي توجه إبرة الحقن المجهري في أنسجة الدماغ عند الاستفادة من الصور المكتسبة من المجهر لتسليم كميات femtoliter من الحل في خلايا واحدة. تزيد العملية الروبوتية مما يؤدي إلى العائد العام الذي هو أمر أكبر من حجم الحقن المجهري اليدوي ويسمح لوضع العلامات الدقيقة والتلاعب المرن للخلايا الفردية في الأنسجة الحية. مع هذا، يمكن للمرء أن microinject مئات الخلايا داخل شريحة organotypic واحد. يوضح هذا المقال استخدام الروبوت الحقن المجهري للمجهر الآلي للخلايا السلف العصبي والخلايا العصبية في شرائح أنسجة الدماغ. على نطاق أوسع، يمكن استخدامه على أي نسيج ظهاري يضم سطح التي يمكن الوصول إليها من قبل ماصة. بمجرد إعدادها ، يمكن للروبوت الحقن المجهري تنفيذ 15 أو أكثر من الحقن المجهري في الدقيقة الواحدة. الروبوت الحقن المجهري بسبب الإنتاجية و versality سيجعل الحقن المجهري تقنية التلاعب بالخلايا عالية الأداء واضحة على نطاق واسع لاستخدامها في الهندسة الحيوية، والتكنولوجيا الحيوية، والفيزياء الحيوية لإجراء تحليلات خلية واحدة في شرائح الدماغ organotypic.
Introduction
يصف هذا البروتوكول استخدام الروبوت لاستهداف الخلايا الفردية ومعالجتها في شرائح أنسجة الدماغ ، مع التركيز بشكل خاص على الخلايا الجذعية العصبية والخلايا العصبية. وقد تم تطوير الروبوت لمعالجة مسألة مركزية في علم الأعصاب التنموية، وهذا هو كيف الجذعية العصبية والخلايا السلف تسهم في تكوين الدماغ1,2,3,4,5. للإجابة على هذا السؤال، يحتاج المرء إلى تسمية وتتبع الخلايا الجذعية العصبية الفردية ومتابعة تقدم نسبها مع مرور الوقت لربط سلوك الخلية الواحدة بتحول الأنسجة. ويمكن تحقيق ذلك بطرق مختلفة، على سبيل المثال، عن طريق كهربية أنسجة المخ في الرحم أو عن طريق وضع علامة على خلية واحدة باستخدام يموت الدهني. على الرغم من قوة، تفتقر هذه الأساليب دقة دقيقة خلية واحدة (الكهربائي) و / أو إمكانية التعامل مع الفضاء داخل الخلايا (صبغة lipophilic). تم تطوير الحقن المجهري في خلايا واحدة للتغلب على هذا التحدي6,7,8. خلال الحقن الدقيق ، يتم إدخال ماصة لفترة وجيزة في خلية واحدة داخل نسيج سليم تحت ضغط لصغر حجم femtoliter من الكواشف9. لقد سبق وصفنا إجراء يدوي للميكونات الخلايا الجذعية العصبية في الأنسجة العضوية(الشكل 1A)10,11. يعتمد الحقن المجهري في الخلايا الجذعية العصبية على استخدام ميكروبيبيت يتم إدخاله في الخلايا الجذعية العصبية الفردية لحقن محلول يحتوي على صبغة فلورية ، إلى جانب جزيئات أخرى ذات أهمية. يتم تحقيق الاستهداف الانتقائي للخلايا الجذعية العصبية عن طريق الاقتراب من التيتنسفالون النامية عبر سطح البطين (أو البطين ، انظر الرسوم المتحركة في الشكل 1A)، التي يتم تشكيلها من قبل غشاء البلازما apical من السلفة apical (الرسوم المتحركة في الشكل 1A). يجب تكرار هذه العملية لكل خلية يرغب المجرب في حقنها. علاوة على ذلك ، يعتمد نجاح الحقن المجهري على التحكم الدقيق في عمق ومدة حقن الدقيق في الأنسجة. وهكذا، على الرغم من المزايا الفريدة، فإن الحقن المجهري اليدوي أمر ممل للغاية ويتطلب ممارسة كبيرة لأداء الإنتاجية والإنتاجية المعقولة، مما يجعل من الصعب استخدام هذه التقنية بطريقة قابلة للتطوير. للتغلب على هذا القيد، قمنا بتطوير مؤخرا الروبوت صورة موجهة، ولصناعة السيارات12 (أو الروبوت الحقن المجهري) التي يمكن أن تؤدي تلقائيا microinjections في خلايا واحدة.
الروبوت microinjection يجعل من استخدام التصوير المجهري وخوارزميات رؤية الكمبيوتر لاستهداف مواقع محددة بدقة في الفضاء 3-D داخل الأنسجة للمجهر (الشكل 1B). يمكن بناء الروبوت الحقن المجهري من خلال إجراء تعديلات بسيطة نسبيا على الإعداد microinjection القائمة. يظهر المخطط العام للروبوت microinjection في الشكل 1C. يتم تركيب ماصة في حامل ماصة تعلق على المتلاعب ثلاثة محاور. يتم استخدام كاميرا المجهر للحصول على صور للأنسجة وإبرة الحقن المجهري. ويستخدم نظام مخصص لتنظيم الضغط للسيطرة على الضغط داخل الماصات ويستخدم micromanipulator للبرمجة للسيطرة على موقف ماصة ناخنة الصغرى. وتستخدم صور الكاميرا للأنسجة وماصة الحقن المجهري لتحديد الموقع المكاني لتلميح ماصات الحقن المجهري والمواقع التي يلزم فيها إجراء الحقن المجهري. ثم يقوم البرنامج بحساب المسارات اللازمة لتحريك الماصات داخل الأنسجة. يتم التحكم في جميع الأجهزة من قبل البرنامج الذي قمنا بتطويره من قبل. جميع البرامج مكتوبة بلغة الترميز (على سبيل المثال، بايثون واردوينو) ويمكن تنزيلها من https://github.com/bsbrl/Autoinjector مع التعليمات. واجهة المستخدم الرسومية (GUI) يسمح للمستخدم لتصوير الأنسجة وmicropipette ، وتخصيص مسار الحقن المجهري. ويمكن إنشاء نظامنا باستخدام تعديلات بسيطة نسبيا على مجهر مقلوب مجهزة برايتفيلد ومرشحات الفلورسينسي epi.
أولا، نحن نقدم تعليمات بشأن إعداد شرائح الأنسجة العضوية في الدماغ للخَرَن المجهري. ثم يوضح البروتوكول بدء الروبوت الحقن المجهري متبوعاً بخطوات تحضيرية، مثل معايرة حركة الماصات، التي يجب القيام بها قبل الحقن المجهري. ويتبع ذلك تحديد المعلمات الحقن. بعد ذلك، يمكن للمستخدم تحديد المسار المستخدم من قبل الروبوت الحقن المجهري وبدء إجراء الحقن. يمكن الاحتفاظ النسيج microinjected (في هذه الحالة شرائح الأنسجة العضوية في الدماغ) في الثقافة لفترات زمنية مختلفة اعتمادا على التصميم التجريبي10،11. يمكن معالجة الأنسجة لمتابعة ودراسة هوية ومصير الخلايا المحقونة وذريتها. بدلا من ذلك، يمكن اتباع الخلايا المجهرية باستخدام التصوير الحي. في نطاق هذا البروتوكول، ونحن نبرهن على استخدام الروبوت تلقائيا microinjection الخلايا السلف العصبي في شرائح organotypic من الماوس E14.5 الظهرية التيفينات. الروبوت هو أكثر قدرة على الحقن المجهري في الخلايا العصبية حديثي الولادة في تيلفينسيفالون الماوس، وكذلك في تيلنفالون الجنين البشري12.
باختصار، نحن وصف منصة الروبوتية التي يمكن استخدامها لمتابعة ومعالجة الخلايا الفردية في الأنسجة. منصة يجعل من استخدام الضغط، وبالتالي، هو تنوعا للغاية فيما يتعلق بالطبيعة الكيميائية للمركب لحقن. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييفها مع الخلايا المستهدفة غير الخلايا الجذعية. ونتوقع أن يكون نظامنا متكيفا بسهولة مع النظم النموذجية الأخرى أيضا.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحقن المجهري في الخلايا الجذعية العصبية واحدة في الأنسجة يوفر ممتازة دقة خلية واحدة ولهذا السبب تم استخدامه لتشريح بيولوجيا الخلية من تطور الخلايا الجذعية العصبية والانتقال مصير(الشكل 2; انظر أيضا10,11,12). يمكن إجراء إجراء الحقن المجهري الآلي على أنواع أخرى من الخلايا في كل من الفئران الجنينية وأنسجة الدماغ البشرية. تظهر النتائج التمثيلية للخَرَن المجهري للخلايا العصبية الوليدة باستهداف السطح القاعدي لـ telencephalon في الشكل 3.
يمكن تطبيق المبدأ الذي تم تأسيسه هنا لاستهداف عدة أنواع مختلفة من الخلايا في أدمغة الماوس الجنينية وأدمغة الإنسان. لقد أظهرنا سابقا أن الروبوت الحقن المجهري يمكن أيضا أن تستخدم لاستهداف الخلايا السلف واحد في الماوس hindbrain وtelencephalon والخلايا العصبية حديثي الولادة في الماوس والإنسان تطوير نيوكورتيكس12. للحصول على أفضل النتائج من إجراء الحقن, ينبغي للمرء أن تحسين جميع الخطوات قبل البدء في الحقن. من المهم أن تدرس بعناية وتحسين إعداد شرائح الأنسجة العضوية من أنسجة المخ(الشكل 1)القابلة للحياة والمحفورة جيداً . ومن الأهمية بمكان أن تكون سريعة في تشريح و تشريح الإجراء يتضح في الشكل 1. لحقن apical التي تستهدف APs، ينبغي للمرء أن يختار شرائح تظهر الاتجاه المثالي للسطح apical. بالنسبة لحقن APs، يكون التوجه المثالي هو عمودي السطح على الجزء السفلي من طبق بيتري. أي اتجاه آخر سوف تكون متساهلة كذلك، ومع ذلك، فإن سطح apical عمودي على طبق بيتري يوفر مساحة أوسع للحقن، وبالتالي زيادة نجاح الحقن. للحقن في الخلايا العصبية, اتجاه شريحة يلعب القليل إلى أي تأثير.
مرة واحدة يتم تحديد شرائح لحقن، وإجراء الحقن لكل شريحة يستغرق حوالي 5 دقائق. بالنظر إلى أن واحدة تعمل مع الأنسجة الحية, ينصح بشدة لتسريع إجراء الحقن. وتحقيقا لهذه الغاية نوصي بوضع جميع المعلمات للحقن عن طريق واجهة المستخدم الرسومية(الشكل 1D)قبل الأنسجة جاهزة، للحد من أي وقت الانتظار لا لزوم لها. لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، الرجاء الرجوع إلى الملف التكميلي.
في حالة ثقافة شريحة طويلة الأجل، والخطوات بعد إجراء الحقن المجهري الآلي يمكن أن تؤثر على صحة الخلايا وبالتالي التجربة. لذلك، فمن المستحسن للغاية لتشغيل اختبار مراقبة الجودة وتحسين شروط ثقافة شريحة. لتقييم صلاحية الخلية بعد تشريح الحقن وإجراء، قمنا EdU وضع العلامات أثناء الثقافة، ونحن كميا عدد من النوى pyknotic (وكيل للخلايا المبرمج) في الثقافات وحقن الأنسجة12. لم تكشف هذه القياسات الكمية عن أي تأثير كبير للضين المجهري على صلاحية الأنسجة (الشكل 2C). نوصي بتشغيل ضوابط الجودة مماثلة مع إنشاء تقطيع الأنسجة العضوية وخط أنابيب الحقن المجهري في المختبر.
بالمقارنة مع الحقن المجهري اليدوي ، يوفر الروبوت الحقن المجهري العديد من المزايا. أولاً، منحنى التعلم للمستخدم أقل حدة بالمقارنة بالحقن اليدوي: سوف يصل المستخدم الجديد إلى كفاءة عالية بعد عدد محدود من الجلسات، عادة 1 أو 2. ثانياً، في حالة الحقن المجهري اليدوي، تتطلب الكفاءة المقارنة شهوراً من التدريب. إجراء الحقن هو أسرع وأكثر كفاءة(الشكل 2B). نحن كمي هذه المعلمات ووجدنا أن الروبوت microinjection تفوقت على المستخدم اليدوي المهرة فيما يتعلق بنجاح الحقن (٪ من الحقن الناجحة / العدد الإجمالي للحقن) وفي العدد الإجمالي للحقن في وحدة الوقت12. وهذا يؤدي إلى زيادة إجمالية 300٪ من كفاءة الحقن (٪ من الحقن الناجح / دقيقة) للروبوت الحقن المجهري مقارنة بالمستخدم الماهر. وكانت الزيادة في الكفاءة أكثر وضوحا عند مقارنة الروبوت الحقن المجهري مع مستخدم مبتدئ ووصلت إلى 700٪. أخيرا وليس آخرا، يمكن بسهولة برمجة الروبوت الحقن المجهري لاستكشاف منهجية جميع المعلمات المكانية. هذا مفيد بشكل خاص عند تكييف الروبوت الحقن المجهري لاستهداف خلايا أو أنسجة جديدة، أو عند استخدام الروبوت الحقن المجهري لأغراض تتطلب دقة مكانية مختلفة.
بناء الروبوت الحقن المجهري يتطلب تغييرات طفيفة على المجهر الفلورية المدى القائمة12. وقد سبق أن قدمنا تعليمات لهذا التكيف في https://github.com/bsbrl/Autoinjector. وبمجرد إعداد الأجهزة، يوفر هذا البروتوكول تفاصيل منهجية رئيسية للقيام بنجاح بعمليات الحقن المجهري الآلي. وعموما، فإن الروبوت الحقن المجهري لديه معدل حقن ناجح يبلغ 15.52 + 2.48 حقن /دقيقة، وهو أكبر بـ 15x من مستخدم عديم الخبرة (1.09 ± 0.67 حقن/دقيقة)، و3x أكبر من مستخدم خبير (4.95 ± 1.05 حقن/دقيقة)12. هذا التحسن في معدل الحقن الناجح يمكّن المستخدمين المبتدئين والخبراء على حد سواء من حقن المزيد من الخلايا في فترة زمنية أقصر وهو أمر ضروري للحفاظ على صلاحية الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، الروبوت الحقن المجهري هو للتخصيص والمسار، وعمق الحقن، وعدد من الحقن، ويمكن ضبطها كل التباعد بين الحقن باستخدام واجهة المستخدم الرسومية. تسمح هذه الميزات باستخدام روبوت الحقن المجهري كأداة لتحسين التجارب الشاقة السابقة ، واستكشاف تجارب جديدة بشكل أساسي تتطلب عائدًا أعلى من الممكن سابقًا.
القيود الرئيسية لإجراء الحقن المجهري التي وصفناها هنا تتعلق بإعداد شرائح الأنسجة ، وهي خطوة حاسمة تحتاج إلى تحسين واسع النطاق. بالإضافة إلى ذلك، يعتمد الحقن المجهري على وجود سطح يمكن الاقتراب منه بواسطة الماصات الزجاجية. هذه الميزة يحد من نوع الأنسجة ومواقع الأنسجة التي يمكن استهدافها عن طريق الحقن المجهري باستخدام الإعداد الحالي.
يستخدم الروبوت الحقن المجهري حاليًا تصوير brightfield وقد تم استخدامه في تحضيرات شريحة الدماغ في المختبر. في المستقبل، يمكن الجمع بين الروبوت الحقن المجهري مع التصوير 2-فوتون لزيادة خصوصية استهداف خلية واحدة في الجسم الحي لوضع العلامات الجزيئية أو الصبغة. وقد بذلت هذه الجهود بالفعل لفيزياء كهربائية خلية واحدة15,16. الجهاز الحالي يتطلب الملاحظة اليدوية من إجراء الحقن المجهري. يمكن أن تشمل الإصدارات المستقبلية استراتيجيات لتنظيف ماصات الحقن المجهري المسدود17 أو دمج الروبوتات مناولة السوائل18 للانكأيشن المجهري متعدد التكسد والمستقل بالكامل. ويمكن لهذه الأجهزة أن تزيد من حجم الحقن المجهري حسب حجمها. يمكن تكييف الخوارزميات للسيطرة المتوازية من ماصات الحقن المجهري متعددة19 تمكين التسليم متعدد العشرات من الأصباغ والكواشف الجزيئية في نفس الخلايا داخل نفس التجارب. وهذا ينطوي على إمكانية فتح سبل جديدة للفحص الجزيئي في الأنسجة.
يمكن استخدام الروبوت الحقن المجهري للإشارة إلى الخلايا المحددة وظيفيًا باستخدام الباركود الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي. ويمكن أن يقترن ذلك بدوره مع تقنيات أخرى لتحليل الخلايا، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي (scRNAseq) والمجهر الإلكتروني. تظهر نتائجنا الأولية أنه يمكن استرداد الخلايا المجهرية وذريتها وعزلها باستخدام تفكك الأنسجة متبوعًا بفرز FACS (Taverna ، النتائج غير المنشورة). يمكن بعد ذلك استخدام الخلايا التي تم فرزها في FACS لـ scRNAseq. وعلاوة على ذلك، تظهر النتائج الأولية أن قدرات دقة الخلية الواحدة للروبوت المجهري يمكن استخدامها بالاقتران مع التحليل المجهري الإلكتروني لاستكشاف بيولوجيا الخلايا على الخلايا الجذعية العصبية في الأنسجة بدقة مكانية عالية (Taverna و Wilsch-Bräuninger، نتائج غير منشورة). وتشير هذه البيانات إلى أن الروبوت الحقن المجهري يمكن استخدامه كأداة للمجهر الخفيف والإلكتروني المترابط في الأنسجة وبمعنى أوسع، للتحليل المتعدد الوسائط لهوية الخلية وسلوكها في الأنسجة.
يعتمد الحقن المجهري على استخدام الضغط ويمكن للمرء أن يتحمل حلول الحقن ذات التعقيد الجزيئي العالي (على سبيل المثال، نسخة كاملة). وقد استغلت هذه الميزة من الحقن المجهري في الماضي لعزل واستنساخ مستقبلات ليجند مسور20. على طول هذا الخط، يمكن استخدام الروبوت الحقن المجهري لنمائد ودراسة الصفات متعددة الgenic على المستوى الخلوي. جنبا إلى جنب مع استراتيجية تجميع فرعي، الروبوت الحقن المجهري يمكن أيضا أن تستخدم كمنصة لتحديد مجموعة الحد الأدنى من الجينات التي تقود سمة معينة / سلوك الخلوية. حتى الآن، وقد استخدم الروبوت الحقن المجهري للتلاعب الكيمياء الحيوية الخلية عن طريق تسليم مرنا، الحمض النووي أو البروتيناتالمؤتلفة 10،21،22. ونتنبأ بتطبيق الروبوت الحقن المجهري في ابراء الفيزياء الحيوية للفضائيات داخل الخلايا، على سبيل المثال، من خلال تقديم المواد النانوية أو المواد النانوية التي تسمح بالاستشعار و/أو التلاعب في الخصائص الفيزيائية الحيوية للمساحة داخل الخلايا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يعترفون بمؤسسة نوميس( ET). SBK يعترف الأموال من قسم الهندسة الميكانيكية، كلية العلوم والهندسة، MnDRIVE RSAM مبادرة من جامعة مينيسوتا ، مينيسوتا قسم التعليم العالي ، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) 1R21NS103098 -01 ، 1R01NS111028 ، 1R34NS111654 ، 1R21NS112886 و 1R21 NS11196. وقد تم دعم GS من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم لأبحاث الدراسات العليا زمالة و NSF IGERT منحة تدريبية.
Materials
| Chemicals | |||
| Agarose, Low Melt | Carl Roth | Cat# 6351.2 | |
| Agarose, Wild Range | Sigma-Aldrich | Cat# A2790 | |
| Best-CA 221 Glue | Best Klebstoffe GmbH & Co.KG | Cat# CA221-10ml | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | Cat# 17504044 | |
| Cellmatrix Type-IA (Collagen, Type !) | FUJIFILM Wako Chemicals | Cat# 637-00653 | |
| Distilled Water | |||
| DMEM-F12, CO2 independent (w/o Phenol red) | Sigma-Aldrich | Cat# D2906 | |
| DMEM-F12, CO2 independent (with Phenol red) | Sigma-Aldrich | Cat# D8900 | |
| HEPES-NAOH, pH 7.2, 1M (HEPES buffer) | Carl Roth | Cat# 9105.3 | |
| L-Glutamine, 200 mM | Thermo Fisher Sientific | Cat# 25030024 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | Cat# 81381 | |
| N-2 Supplement | Thermo Fisher Scientific | Cat# 17502048 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | Cat# 21103049 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | Cat# AM9937 | |
| O2 (40%), CO2 (5%), N2 (55%) Mix, 50 liters | |||
| Paraformaldehyde | Merck | Cat# 818715 | |
| PBS | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15140122 | |
| Rat serum | Charles River Laboratories | ||
| Japan | |||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | Cat# 106323 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | Cat# 106482 | |
| Tyrode’s salt | Sigma | Cat# T2145-10x1L) | |
| Equipment | |||
| Borosilicate glass capillaries, 1.2 mm outer diameter x 0.94 mm inner diameter | Sutter Instruments | Cat# BF-120-94-10 | |
| Bottle-top filter system, 500 mL | Corning | Cat# 430769 | |
| Computer PC | |||
| Custom pressure rig | Custom pressure rig | ||
| Electronic pressure regulator | Parker Hannifin | Cat# 990-005101-002 | |
| Falcon tubes, 15 mL | Corning | Cat# 430791 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Corning | Cat# 430829 | |
| Fine-tip paintbrush | |||
| Flaming/ Brown micropipette puller | Sutter Instruments | Cat# P-97 | |
| Forceps, Dumont no. 3 | Fine Science Tools | Cat# 11231-30 | |
| Forceps, Dumont no. 5 | Fine Science Tools | Cat# 11255-20 | |
| Forceps, Dumont no. 55 | Fine Science Tools | Cat# 11252-20 | |
| Heating block | Labtech International | Cat # Dri block Digi2 | |
| Inverted fluorescence microscope | Zeiss | Cat# Axiovert 200 | |
| Light source | Olympus | Cat# Highlight 3100 | |
| Manual pressure regulator | McMaster Carr | Cat# 0-60 PSI 41795K3 | |
| Microloader Tips | Eppendorf | Cat# 5242956.003 | |
| Microcontroller | Arduino | Cat# Arduino Due | |
| Microscope camera Hamamatsu Orca Flash 4.0 V3 | |||
| Motorized stage XY for microscope | |||
| Multiwell plate, 24 wells | Nunc | Cat# 142475 | |
| Pasteur pipettes, plastic | |||
| Petri dish, 60 x 15 mm | Greiner | Cat# 628102 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Nunc | Cat# 153066 | |
| Petri dish, 34 x 14 mm, including Microwell no. 1.5 cover glass | MatTek | Cat# P35G-1.5-14-C | |
| Pipette holder | Warner Instruments | Cat# 64-2354 MP-s12u | |
| Pipette and tips | |||
| Puller filament, 3.0-mm square box filament | Sutter Instrument | Cat# FB330B | |
| Slice culture incubation box | MPI-CBG | Cat# custom made | |
| Solenoid valve | Cat# LHDA053321H-A | ||
| Stereomicroscope | Olympus | Cat# SZX12 | |
| Tabletop centrifuge | Heraeus | Cat# 5431622 | |
| Thermometer | |||
| Three-axis Manipulator | Sensapex Inc | Cat# tree-axis uMP | |
| Vibratome | Leica | Cat# VT1000s | |
| Whole-embryo-culture-system incubator | Ikemoto Company | Cat# RKI-10-0310 | |
| Waterbath | |||
| Software and Algorithms | |||
| Arduino | Arduino | ||
| Fiji | RRID: SCR_002285 | ||
| Python | Python Software foundation | Python 2.7.12 | |
| ZEN | RRID: SCR_013672 |
References
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 465-502 (2014).
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (10), 777-788 (2005).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesisin a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Developmental Cell. 38 (6), 590-600 (2016).
- Pepperkok, R. et al. Automatic microinjection system facilitates detection of growth inhibitory mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (18), 6748-6752 (1988).
- Pepperkok, R., Lowe, M., Burke, B., Kreis, T. E. Three distinct steps in transport of vesicular stomatitis virus glycoprotein from the ER to the cell surface in vivo with differential sensitivities to GTPγS. Journal of Cell Science. 111 (13), 1877-1888 (1998).
- Pepperkok, R. et al. β-COP is essential for biosynthetic membrane transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi complex in vivo. Cell. 74 (1), 71-82 (1993).
- Ansorge, W., Pepperkok, R. Performance of an automated system for capillary microinjection into living cells. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 16 (4), 283-292 (1988).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neuroscience. 15 (2), 329-337 (2012).
- Wong, F. K., Haffner, C., Huttner, W. B., Taverna, E. Microinjection of membrane-impermeable molecules into single neural stem cells in brain tissue. Nature Protocols. 9 (5), 1170-1182 (2014).
- Shull, G., Haffner, C., Huttner, W. B., Kodandaramaiah, S. B., Taverna, E. Robotic platform for microinjection into single cells in brain tissue. EMBO Reports. 20 (10), e47880 (2019).
- Jabeen, S., Thirumalai, V. The interplay between electrical and chemical synaptogenesis. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1914-1922 (2018).
- Nagy, J. I., Pereda, A. E., Rash, J. E. Electrical synapses in mammalian CNS: Past eras, present focus and future directions. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1860 (1), 102-123 (2018).
- Suk, H.J. et al. Closed-loop real-time imaging enables fully automated cell-targeted patch-clamp neural recording in vivo. Neuron. 95 (5), 1037-1047 (2017).
- Annecchino, L. A. et al. Robotic automation of in vivo two-photon targeted whole-cell patch-clamp electrophysiology. Neuron. 95 (5), 1048-1055 (2017).
- Kolb, I. et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Scientific Reports. 6, 35001 (2016).
- Holst, G. L. et al. Autonomous patch-clamp robot for functional characterization of neurons in vivo: development and application to mouse visual cortex. Journal of Neurophysiology. 121 (6), 2341-2357 (2019).
- Kodandaramaiah, S. B. et al. Multi-neuron intracellular recording 1 in vivo via interacting autopatching 2 robots. ELife. 7, 24656 (2018).
- Lubbert, H. et al. cDNA cloning of a serotonin 5-HT1c receptor by electrophysiological assays of mRNA-injected Xenopus oocytes (RNA fractionation/hybrid depletion/hybrid selection/choroid plexus/voltage clamp). Neurobiology. 84 (2) 4332-4336 (1987).
- Florio, M. et al. Human-specific gene ARHGAP11B promotes basal progenitor amplification and neocortex expansion. Science. 347 (6229), 1465-1470 (2015).
- Kalebic, N. et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
