تمايز أحاديات في الضامة الظاهرية متميزة بعد العلاج مع الخلايا الجذعية دم الحبل السري البشري (CB-SC) إكسوسوم المستمدة
Summary
تطبيق إكسوسووم هو أداة ناشئة لتطوير الأدوية والطب التجديدي. نحن ننشئ بروتوكول عزل إكوسوم مع نقاء عالية لعزل إكسوسومات من الخلايا الجذعية رواية محددة تسمى CB-SC للدراسات الميكانيكية. نحن أيضا coculture CB-SC المستمدة من الاكسوس مع monocytes الإنسان، مما يؤدي إلى تمايزها إلى الضامة المتميزة الظاهري.
Abstract
علاج اختصاصي الخلايا الجذعية (SCE) هو نهج سريري جديد لعلاج مرض السكري من النوع 1 وأمراض المناعة الذاتية الأخرى. يعمم العلاج SCE خلايا الدم أحادية النواة للمريض المعزول (على سبيل المثال، الخلايا اللمفاوية والموحدات) من خلال جهاز استئصال الخلايا السفلية، ويشارك في الثقافات خلايا الدم أحادية النوى للمريض مع الخلايا الجذعية المشتقة من دم الحبل السري (CB-SC) في جهاز SCE، ثم تعيد هذه الخلايا المناعية “المتعلمة” إلى دم المريض. Exosomes هي الحويصلات خارج الخلية بحجم نانو بين 30\u2012150 نانومتر الموجودة في جميع وسائل الإعلام ثقافة الخلايا والخلايا الحيوية. لمزيد من استكشاف الآليات الجزيئية الكامنة تحت العلاج SCE وتحديد إجراءات exosomes الافراج عن CB-SC، ونحن التحقيق في الخلايا التي phagocytize هذه الكوسومات أثناء العلاج مع CB-SC. من خلال المشاركة في زراعة ديو المسمى بـ CB-SC المشتقة من الإزقاقات مع خلايا أحادية النوى الدموية الطرفية البشرية (PBMC) ، وجدنا أن الإكزومات المشتقة من CB-SC تم تناولها في الغالب من قبل monocytes البشرية ذات CD14 الإيجابية ، مما يؤدي إلى تمايز أحادية في النوع 2 الضامة (M2) ، مع مورفولوجيا تشبه المغزل وتعبير العلامات الجزيئية السطحية المرتبطة بـ M2. هنا، نقدم بروتوكول لعزل وتوصيف اكسوزومات مشتقة من CB-SC والبروتوكول للثقافة المشتركة من الاكسوس المستمدة من CB-SC مع monocytes الإنسان ورصد التمايز M2.
Introduction
الخلايا الجذعية لدم الحبل السري (CB-SC) هي نوع فريد من الخلايا الجذعية التي تم تحديدها من دم الحبل السري البشري وتتميز عن الأنواع الأخرى المعروفة من الخلايا الجذعية مثل الخلايا الجذعية الميزينشية (MSC) والخلايا الجذعية الدموية (HSC)1. استنادا إلى خصائص فريدة من نوعها من التشكيل المناعي وقدرتها على الالتزام بإحكام إلى سطح أطباق بيتري، وضعنا تقنية جديدة معينة كمربي الخلايا الجذعية (SCE) العلاج في التجارب السريرية2،3. أثناء العلاج SCE ، يتم جمع خلايا الدم الأحادية الطرفية للمريض (PBMC) وتعميمها من خلال فاصل الخلايا والمشاركة في الثقافة مع CB-SC في المختبر. ثم تعاد هذه الخلايا “المتعلمة” (CB-SC-تعامل PBMC) إلى الدورة الدموية للمريض في نظام حلقة مغلقة. وقد أثبتت التجارب السريرية بالفعل السلامة السريرية وفعالية العلاج SCE لعلاج أمراض المناعة الذاتية بما في ذلك مرض السكري من النوع 1 (T1D)2,4 و الثعلبة areata (AA)5.
Exosomes هي عائلة من الجسيمات النانوية مع أقطار تتراوح 30\u2012150 نانومتر، وتوجد في جميع وسائل الإعلام بيوفلورويد والخلايا ثقافة6. يتم إثراء إكسوسومات مع العديد من الجزيئات النشطة بيولوجيا بما في ذلك الدهون، mRNAs، والبروتينات، وmicroRNAs (ميرنا)، وتلعب دورا هاما في الاتصالات من خلية إلى خلية. في الآونة الأخيرة، أصبحت اكسوزومات أكثر جاذبية للباحثين وشركات الأدوية نظرا لإمكاناتهم العلاجية في العيادات7،8،9. في الآونة الأخيرة، أظهرت دراساتنا الميكانيكية أن الإكسوسومات CB-SC التي تم إصدارها تساهم في التشكيل المناعي للعلاج SCE10.
هنا، ونحن وصف البروتوكول لاستكشاف آلية العلاج SCE استهداف monocytes بواسطة اكسوزومات CB-SC صدر. أولاً، تم عزل الاستئصالات الصادرة من CB-SC من الوسائط المكيفة المشتقة من CB-SC باستخدام أساليب الاستئصال الفائق والتحقق من صحتها عن طريق قياس التدفق، واللطخة الغربية (البنك الدولي) وتشتت الضوء الديناميكي (DLS). ثانياً، تم تسمية الكوسومات المشتقة من CB-SC بصبغة شفة خضراء فلورية: ديو. ثالثاً، كانت هذه المنشآت مُزَمَّقة مع PBMC لدراسة النسب المئوية الإيجابية من الإزوسومات المشتقة من ديو CB-SC في المنشآت الفرعية المختلفة من PBMC بواسطة عملية استئصال الخلايا المتدفقة. يوفر هذا البروتوكول إرشادات لدراسة عمل الإكسوسومات الكامنة في التشكيل المناعي للخلايا الجذعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تطبيق الإكسوسوم هو مجال ناشئ للتشخيص السريري، والتطورات الدوائية والطب التجديدي. هنا، نقدم بروتوكول مفصل بشأن إعداد اكسوزومات مشتقة من مادة CB-SC والدراسة الوظيفية للاكسوسومات على التمييز بين أحاديات الإنسان. أظهر البروتوكول الحالي أن الإكسوسومات الوظيفية المشتقة من SC يتم عزلها بالطرد ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للسيد بوددار والسيد لودفيغ على الدعم السخي للتمويل من خلال مؤسسة هاكينساك UMC. ونحن نقدر لورا تشاو لتحرير اللغة الإنجليزية.
Materials
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. . Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).
