Differenzierung von Monozyten in phänotypisch ausgeprägte Makrophagen nach der Behandlung mit humanen Cordblutstammzellen (CB-SC)-Abgeleitete Exosomen
Summary
Exosome Anwendung ist ein aufkommendes Werkzeug für die Arzneimittelentwicklung und regenerative Medizin. Wir etablieren ein Exosomen-Isolationsprotokoll mit hoher Reinheit, um Exosomen aus neuartigen identifizierten Stammzellen namens CB-SC für mechanistische Studien zu isolieren. Wir kokulturieren auch CB-SC-abgeleitete Exosomen mit menschlichen Monozyten, was zu ihrer Differenzierung in phänotypisch unterschiedliche Makrophagen führt.
Abstract
Die Stammzellpädagogin (SCE) therapie ist ein neuartiger klinischer Ansatz zur Behandlung von Typ-1-Diabetes und anderen Autoimmunerkrankungen. Die SCE-Therapie zirkuliert die mononukleären Blutzellen des isolierten Patienten (z. B. Lymphozyten und Monozyten) durch eine Apherese-Maschine, ko-kulturen die mononukleären Blutzellen des Patienten mit anhaftenden Nabelschnurblut-abgeleiteten Stammzellen (CB-SC) im SCE-Gerät und geben diese “gebildeten” Immunzellen dann in das Blut des Patienten zurück. Exosomen sind nanogroße extrazelluläre Vesikel zwischen 30 und 2012150 nm, die in allen Biofluid- und Zellkulturmedien vorhanden sind. Um die molekularen Mechanismen, die der SCE-Therapie zugrunde liegen, weiter zu erforschen und die Aktionen von aus CB-SC freigesetzten Exosomen zu bestimmen, untersuchen wir, welche Zellen diese Exosomen während der Behandlung mit CB-SC phagozytisieren. Durch die Co-Kultivierung von DIO-markierten CB-SC-abgeleiteten Exosomen mit menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) fanden wir heraus, dass CB-SC-abgeleitete Exosomen überwiegend von menschlichen CD14-positiven Monozyten aufgenommen wurden, was zur Differenzierung von Monozyten in Typ-2-Makrophagen (M2) mit spindelähnlicher Morphologie und Expression von M2-assoziierten Oberflächenmolekularmarkern führte. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von CB-SC-abgeleiteten Exosomen und das Protokoll für die Kokultur von CB-SC-abgeleiteten Exosomen mit menschlichen Monozyten und die Überwachung der M2-Differenzierung vor.
Introduction
Cord-Blut-Stammzellen (CB-SC) sind einzigartige Stammzellen, die aus menschlichem Nabelschnurblut identifiziert wurden und sich von anderen bekannten Arten von Stammzellen wie mesenchymalen Stammzellen (MSC) und hämatopoetischen Stammzellen (HSC)1unterscheiden. Basierend auf ihren einzigartigen Eigenschaften der Immunmodulation und ihrer Fähigkeit, sich fest an der Oberfläche von Petrischalen zu halten, haben wir in klinischen Studien2,3eine neue Technologie entwickelt, die als Stammzellpädagoge (SCE)-Therapie bezeichnet wird. Während der SCE-Therapie werden die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) eines Patienten gesammelt und durch einen Zellabscheider zirkuliert und mit dem angegobenen CB-SC in vitro kokultiviert. Diese “gebildeten” Zellen (CB-SC-behandelte PBMC) werden dann in einem geschlossenen Kreislaufsystem in den Kreislauf des Patienten zurückgeführt. Klinische Studien haben bereits die klinische Sicherheit und Wirksamkeit der SCE-Therapie zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen einschließlich Typ-1-Diabetes (T1D)2,4 und Alopecia areata (AA)5nachgewiesen.
Exosomen sind eine Familie von Nanopartikeln mit Durchmessern von 30 bis 2012150 nm und existieren in allen Biofluid- und Zellkulturmedien6. Exosomen sind mit vielen bioaktiven Molekülen angereichert, einschließlich Lipiden, mRNAs, Proteinen und microRNAs (miRNA), und spielen eine wichtige Rolle in der Zell-zu-Zell-Kommunikation. In letzter Zeit sind Exosomen für Forscher und Pharmaunternehmen aufgrund ihrer therapeutischen Potenziale in Kliniken7,8,9attraktiver geworden. Kürzlich haben unsere mechanistischen Studien gezeigt, dass CB-SC-freigesetzte Exosomen zur Immunmodulation der SCE-Therapiebeitragen 10.
Hier beschreiben wir das Protokoll zur Untersuchung des Mechanismus der SCE-Therapie, die auf Monozyten durch CB-SC-freigesetzte Exosomen abzielt. Erstens wurden CB-SC-freigesetzte Exosomen mit Ultrazentrifugationsmethoden aus CB-SC-abgeleiteten konditionierten Medien isoliert und durch Durchflusszytometrie, Western Blot (WB) und dynamische Lichtstreuung (DLS) validiert. Zweitens wurden CB-SC-abgeleitete Exosomen mit einem grünen fluoreszierenden lipophilen Farbstoff gekennzeichnet: Dio. Drittens wurden sie gemeinsam mit PBMC kultiviert, um die positiven Prozentsätze von Dio-markierten CB-SC-abgeleiteten Exosomen an den verschiedenen Subpopulationen von PBMC durch Durchflusszytometrie zu untersuchen. Dieses Protokoll enthält Anleitungen zur Untersuchung der Wirkung von Exosomen, die der Immunmodulation von Stammzellen zugrunde liegen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Anwendung von Exosomen ist ein aufstrebendes Feld für klinische Diagnostik, Arzneimittelentwicklungen und regenerative Medizin. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von CB-SC-abgeleiteten Exosomen und zur funktionellen Untersuchung von Exosomen zur Differenzierung menschlicher Monozyten vor. Das aktuelle Protokoll zeigte, dass funktionelle CB-SC-abgeleitete Exosomen durch sequentielle Zentrifugation und Ultrazentrifugation mit hoher Reinheit isoliert werden und die Immunmodulation auf Monozyt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Herrn Poddar und Herrn Ludwig für die großzügige Finanzielle Unterstützung über die Hackensack UMC Foundation. Wir schätzen Laura Zhao für die englische Bearbeitung.
Materials
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
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