Differentiatie van monocyten in fenotypisch verschillende macrofagen na behandeling met Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Afgeleide Exosomen
Summary
Exosoom toepassing is een opkomende tool voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en regeneratieve geneeskunde. We stellen een exosoom isolatieprotocol op met een hoge zuiverheid om exosomen te isoleren van nieuw geïdentificeerde stamcellen genaamd CB-SC voor mechanistische studies. We cocultuur cb-sc-afgeleide exosomen met menselijke monocyten, wat leidt tot hun differentiatie in fenotypically verschillende macrofagen.
Abstract
Stamcel educator (SCE) therapie is een nieuwe klinische aanpak voor de behandeling van type 1 diabetes en andere auto-immuunziekten. SCE-therapie circuleert de bloedmononucleaire cellen van de geïsoleerde patiënt (bijvoorbeeld lymfocyten en monocyten) via een aferesemachine, co-culturen van de patiënt bloed mononucleaire cellen met aanhangende navelstrengbloed afgeleide stamcellen (CB-SC) in de SCE-apparaat, en vervolgens keert deze “opgeleide” immuuncellen naar het bloed van de patiënt. Exosomen zijn nano-sized extracellulaire vesicles tussen 30\u2012150 nm bestaande in alle biofluïde en celkweek media. Om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan SCE-therapie verder te onderzoeken en de acties van exosomen die vrijkomen bij CB-SC te bepalen, onderzoeken we welke cellen deze exosomen phagocytiseren tijdens de behandeling met CB-SC. Door dio-gelabelde CB-SC-afgeleide exosomen met menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) mede te kweken, ontdekten we dat cb-SC-afgeleide exosomen voornamelijk werden overgenomen door menselijke CD14-positieve monocyten, wat leidde tot de differentiatie van monocyten in type 2 macrofagen (M2), met spindelachtige morfologie en expressie van M2-geassocieerde oppervlaktemoleculaire markers. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie en karakterisering van cb-SC-afgeleide exosomen en het protocol voor de co-cultuur van CB-SC-afgeleide exosomen met menselijke monocyten en het toezicht op M2 differentiatie.
Introduction
Navelstrengbloedstamcellen (CB-SC) zijn uniek type stamcellen die zijn geïdentificeerd uit menselijk navelstrengbloed en onderscheiden zich van andere bekende soorten stamcellen zoals mesenchymale stamcellen (MSC) en hematopoietische stamcellen (HSC)1. Op basis van hun unieke eigenschappen van immuunmodulatie en hun vermogen om zich strak aan het oppervlak van petrischaaltjes te houden, ontwikkelden we een nieuwe technologie die is aangewezen als Stem Cell Educator (SCE) therapie in klinische studies2,3. Tijdens de SCE-therapie worden de perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) van een patiënt verzameld en verspreid via een celafscheider en co-gekweekt met aanhangende CB-SC in vitro. Deze “opgeleide” cellen (CB-SC-behandelde PBMC) worden vervolgens teruggegeven aan de circulatie van de patiënt in een gesloten-lus systeem. Klinische studies hebben al aangetoond dat de klinische veiligheid en werkzaamheid van SCE-therapie voor de behandeling van auto-immuunziekten, waaronder type 1 diabetes (T1D)2,4 en alopecia areata (AA)5.
Exosomen zijn een familie van nanodeeltjes met diameters variërend 30\u2012150 nm en bestaan in alle biofluïde en celkweek media6. Exosomen zijn verrijkt met vele bioactieve moleculen, waaronder lipiden, mRNAs, eiwitten en microRNAs (miRNA), en spelen een belangrijke rol in cel-tot-cel communicatie. De laatste tijd zijn exosomen aantrekkelijker geworden voor onderzoekers en farmaceutische bedrijven vanwege hun therapeutische mogelijkheden in klinieken7,8,9. Onlangs hebben onze mechanistische studies aangetoond dat CB-SC-vrijgegeven exosomen bijdragen aan de immuunmodulatie van SCE therapie10.
Hier beschrijven we het protocol om het mechanisme van SCE-therapie te verkennen gericht op monocyten door CB-SC-vrijgegeven exosomen. Ten eerste werden door CB-SC vrijgegeven exosomen geïsoleerd van door CB-SC afgeleide geconditioneerde media met behulp van ultracentrifugeringsmethoden en gevalideerd door stromingscytometrie, western blot (WB) en dynamic light scattering (DLS). Ten tweede werden cb-SC-afgeleide exosomen gelabeld met een groene fluorescerende lipofiele kleurstof: Dio. Ten derde werden ze samen met PBMC gecoökt om de positieve percentages van dio-gelabelde CB-SC-afgeleide exosomen te onderzoeken op de verschillende subpopulaties van PBMC door flow cytometrie. Dit protocol biedt richtlijnen om de werking van exosomen te bestuderen die ten grondslag liggen aan de immuunmodulatie van stamcellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Toepassing van exosomen is een opkomend gebied voor klinische diagnose, medicijnontwikkelingen en regeneratieve geneeskunde. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol met betrekking tot de voorbereiding van cb-SC-afgeleide exosomen en de functionele studie van exosomen over de differentiatie van menselijke monocyten. Het huidige protocol toonde aan dat functionele CB-SC-afgeleide exosomen worden geïsoleerd door sequentiële centrifugatie en ultracentrifugatie met een hoge zuiverheid en het vertonen van de immuunmod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn de heer Poddar en de heer Ludwig dankbaar voor de genereuze financiering via Hackensack UMC Foundation. We waarderen Laura Zhao voor Engelse montage.
Materials
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. . Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).
