Summary

Diferenciação de monócitos em macrófagos fenotipicamente distintos após o tratamento com células-tronco do sangue do cordão humano (CB-SC)-Exósmos derivados

Published: November 12, 2020
doi:

Summary

A aplicação de exosomo é uma ferramenta emergente para o desenvolvimento de medicamentos e medicina regenerativa. Estabelecemos um protocolo de isolamento exossomo com alta pureza para isolar exosóis de células-tronco identificadas chamadas CB-SC para estudos mecanicistas. Também cocultura cb-SC-derivado exosósmos com monócitos humanos, levando à sua diferenciação em macrófagos fenotipicamente distintos.

Abstract

A terapia com células-tronco (SCE) é uma nova abordagem clínica para o tratamento de diabetes tipo 1 e outras doenças autoimunes. A terapia de CIP circula as células mononucleares sanguíneas isoladas do paciente (por exemplo, linfócitos e monócitos) através de uma máquina de aferese, co-culturas as células mononucleares sanguíneas do paciente com células-tronco derivadas do sangue do cordão aderente (CB-SC) no dispositivo SCE e, em seguida, devolve essas células imunes “educadas” ao sangue do paciente. Exosóis são vesículas extracelulares de tamanho nano-tamanho entre 30\u2012150 nm existentes em todos os meios de cultura biofluida e celular. Para explorar ainda mais os mecanismos moleculares subjacentes à terapia SCE e determinar as ações de exosóis liberados do CB-SC, investigamos quais células fagocitizam esses exosóis durante o tratamento com CB-SC. Ao co-culturar exosóis derivados do CB-SC com células mononucleares de sangue periféricos (PBMC), descobrimos que exosóis derivados do CB-SC foram predominantemente tomados por monócitos humanos CD14-positivos, levando à diferenciação de monócitos em macrófagos tipo 2 (M2), com morfologia semelhante ao fuso e expressão de marcadores moleculares de superfície associados a M2. Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento e caracterização de exosóis derivados do CB-SC e o protocolo para a co-cultura de exosóis derivados do CB-SC com monócitos humanos e o monitoramento da diferenciação M2.

Introduction

As células-tronco do sangue do cordão umbilical (CB-SC) são um tipo único de células-tronco identificadas do sangue do cordão humano e distinguem-se de outros tipos conhecidos de células-tronco, como células-tronco mesenquimais (MSC) e células-tronco hematopoiéticas (HSC)1. Com base em suas propriedades únicas de modulação imunológica e sua capacidade de aderir firmemente à superfície das placas de Petri, desenvolvemos uma nova tecnologia designada como terapia de Educador de Células-Tronco (SCE) em ensaios clínicos2,3. Durante a terapia de SCE, as células mononucleares de sangue periféricos (PBMC) são coletadas e circuladas através de um separador celular e co-cultivadas com cb-SC aderente in vitro. Essas células “educadas” (PBMC tratada pelo CB-SC) são então devolvidas à circulação do paciente em um sistema de loop fechado. Os ensaios clínicos já demonstraram a segurança clínica e a eficácia da terapia de ED para o tratamento de doenças autoimunes, incluindo diabetes tipo 1 (T1D)2,4 e alopecia areata (AA)5.

Exosóis são uma família de nanopartículas com diâmetros que variam de 30\u2012150 nm e existem em todos os meios biofluidos e de cultura celular6. Exosóis são enriquecidos com muitas moléculas bioativas, incluindo lipídios, mRNAs, proteínas e microRNAs (miRNA), e desempenham um papel importante nas comunicações célula-célula. Ultimamente, os exósmos tornaram-se mais atraentes para pesquisadores e empresas farmacêuticas devido aos seus potenciais terapêuticos nas clínicas7,8,9. Recentemente, nossos estudos mecanicistas demonstraram que exosóis liberados pelo CB-SC contribuem para a modulação imunológica da terapia SCE10.

Aqui, descrevemos o protocolo para explorar o mecanismo da terapia SCE visando monócitos por exosóis liberados pela CB-SC. Primeiro, os exosóis liberados pelo CB-SC foram isolados da mídia condicionada pelo CB-SC usando métodos de ultracentrifugação e validados por citometria de fluxo, mancha ocidental (WB) e dispersão dinâmica de luz (DLS). Em segundo lugar, os exosóis derivados do CB-SC foram rotulados com um corante lipofílico fluorescente verde: Dio. Em terceiro lugar, foram co-cultivados com o PBMC para examinar os percentuais positivos de exosóis derivados do CB-SC rotulados por Dio nas diferentes subpopulações do PBMC por citometria de fluxo. Este protocolo fornece orientação para estudar a ação de exosóis subjacentes à modulação imunológica das células-tronco.

Protocol

O protocolo segue as diretrizes do comitê institucional de ética em pesquisa humana do Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Unidades de sangue de casacos de buffy humanos foram compradas no Blood Center de Nova York (Nova York, NY). Unidades de sangue do cordão umbilical humano foram coletadas de doadores saudáveis e compradas do banco de sangue Cryo-Cell International (Oldsmar, FL). Tanto o Hemocente de Nova York quanto o Crio-Cell receberam todas as credenciais para coletas e distribuiç…

Representative Results

Inicialmente, o fenótipo e a pureza do CB-SC foram examinados por citometria de fluxo com marcadores associados ao CB-SC, como o antígeno comum de leucócito CD45, os fatores de transcrição específicos da célula ES OCT3/4 e SOX2. CB-SC exibe altos níveis de CD45, OUT3/4, SOX2, CD270 e expressão galectin 9, mas nenhuma expressão de CD34(Figura 1A). A análise da citometria de fluxo confirmou a expressão de marcadores específicos exossomos, incluindo CD9, CD81 e CD63, em exosóis de…

Discussion

A aplicação de exosóis é um campo emergente para diagnóstico clínico, desenvolvimento de medicamentos e medicina regenerativa. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado sobre a preparação de exosóis derivados do CB-SC e o estudo funcional de exosóis sobre a diferenciação de monócitos humanos. O protocolo atual demonstrou que os exosóis funcionais derivados do CB-SC são isolados por centrifugação sequencial e ultracentrifugação com alta pureza e exibindo a modulação imunológica em monócitos.

<p …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Somos gratos ao Sr. Poddar e ao Sr. Ludwig pelo generoso apoio de financiamento através da Fundação Hackensack UMC. Agradecemos laura Zhao pela edição em inglês.

Materials

1.5 ml Microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-129
15 ml conical tube Falcon 352196
24-well plate Falcon 351147 Non-tissue culture
plate
3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) Millipore sigma D4292-20MG Store at 4 °C
300 Mesh Grids Ted Pella 1GC300
50 mL conical tube Falcon 352070
6-well plate Falcon 353046 Tissue culture plate
96-well plate Falcon 353072 Tissue culture plate
ACK Lysis Buffer Lonza 10-548E 100 ml
Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit Millipore sigma UFC901024
Anti-Human Alix Biolegend 634501 store at 4 °C, RRID: AB_2268110
Anti-Human Calnexin Biolegend 699401 store at 4 °C, RRID: AB_2728519
Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 BD Bioscience 561356 store at 4 °C, RRID: AB_10611859
Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange Beckman Coulter B36294 store at 4 °C, RRID: AB_2728099
Anti-Human CD163 antibody, PE BD Bioscience 556018 store at 4 °C, RRID: AB_396296
Anti-Human CD19 antibody, PC5 Beckman Coulter IM2643U store at 4 °C, RRID: AB_131160
Anti-Human CD206 antibody, FITC BD Bioscience 551135 store at 4 °C, RRID: AB_394065
Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 BD Bioscience 564127 store at 4 °C, RRID: AB_2738610
Anti-Human CD270 antibody, PE Biolegend 318806 store at 4 °C, RRID: AB_2203703
Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue Biolegend 300431 store at 4 °C, RRID: AB_1595437
Anti-Human CD34 antibody, APC Beckman Coulter IM2427U store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD4 antibody, APC BD Bioscience 555349 store at 4 °C, RRID: AB_398593
Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 Beckman Coulter IM3548U store at 4 °C, RRID: AB_1575969
Anti-Human CD56 antibody, PE Beckman Coulter IM2073U store at 4 °C, RRID: AB_131195
Anti-Human CD63 antibody,PE BD Bioscience 561925 store at 4 °C, RRID: AB_10896821
Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 Beckman Coulter A94686 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD80 antibody, APC Beckman Coulter B30642 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD81 antibody, FITC BD Bioscience 561956 store at 4 °C, RRID: AB_394049
Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 Beckman Coulter B30646 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD9 antibody, FITC ThermoScientic MA5-16860 store at 4 °C, RRID: AB_2538339
Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 Biolegend 348919 store at 4 °C, RRID: AB_2716134
Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 ThermoScientic 50-5841-82 store at 4 °C, RRID: AB_11218882
Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 ThermoScientic 53-9811-82 store at 4 °C, RRID: AB_2574479
BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A1933
Buffy coat New York Blood Center 40-60 ml/unit
Cell scraper Falcon 353085
Disposable semi-micro cuvette VWR 97000590
Dissociation buffer Gibco 131510014 100 ml
Dual-Chanber cell counting slides Bio-Rad 1450015
Exosome-Human CD63 Detection reagent ThermoFisher Scientific 10606D store at 4 °C
Ficoll-Paque PLUS density grandient media GE Health 17-1440-03 500 ml
Fixed-Angle Rotor(25°) Thermo Scientifc 75003698 Maxium 24,700 x g
Gallios flow cytometer Beckman Coulter 3 lasers
10 Color Max
Human cord blood Cryo-Cell International 40-100 ml/unit
Human Fc Block BD Bioscience 564220 store at 4 °C
Immun-Blot PVDF membrane Bio-Rad 1620177
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore Sigma SLGP033RS
Optima XE-90 Ultracentriguge Beckman Coulter
Orbital Shaker MP4 BioExpress S-3500-1
PBS ThermoFisher Scientific 10010049 500 ml
Propidium Iodide BD Bioscience 56-66211E store at 4 °C
Nikon Eclipse Ti2 microscope Nikon instruments Inc Eclipse Ti2 NIS-Elements software version 5.11.02
Hochest 33342 Thermo Scientifc 62249 5 ml
Revert microsopy Fisher scientific 12563518
Rotor 41 Ti Beckman Coulter 331362 Maxium 41,000 rpm
Sorvall St 16R Centrifuge Thermo Scientifc 75004381
Swinging Bucket Rotor Thermo Scientifc 75003655
TC-20 cell counter Bio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator ThermoFisher Scientific
Transmission electron microscopy JEOL JEM-2100 PLUS
Ultracentrifuge tube Beckman Coulter 331372
X'VIVO 15 Serum-free medium Lonza BEBP04-744Q 1000 ml Culture medium, store at 4 °C

References

  1. Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
  2. Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
  3. Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
  4. Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
  5. Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87 (2015).
  6. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  7. Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
  8. Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
  9. Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
  10. Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
  11. Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
  12. Dykstra, M. J., Reuss, L. E. . Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).
  13. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  15. Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).

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Cite This Article
Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes. J. Vis. Exp. (165), e61562, doi:10.3791/61562 (2020).

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