Дифференциация моноцитов в фенотипически различные макрофаги после лечения стволовыми клетками крови человека (CB-SC)-Производные экзосомы
Summary
Экзосомное применение является новым инструментом для разработки лекарственных средств и регенеративной медицины. Мы устанавливаем протокол экзосомной изоляции с высокой чистотой, чтобы изолировать экзосомы от новых выявленных стволовых клеток под названием CB-SC для механистических исследований. Мы также совместно культуры CB-SC полученных экзосом с человека моноцитов, что приводит к их дифференциации в фенотипически различных макрофагов.
Abstract
Терапия стволовыми клетками (SCE) является новым клиническим подходом для лечения диабета типа 1 и других аутоиммунных заболеваний. SCE терапия циркулирует изолированных моноядерных клеток крови пациента (например, лимфоцитов и моноцитов) через афереза машины, совместно культур крови пациента моноядерных клеток с адептом пуповинной крови стволовых клеток (CB-SC) в устройстве SCE, а затем возвращает эти “образованные” иммунные клетки в кровь пациента. Экзосомы являются наноразмерными внеклеточными пузырьками между 30-2012150 нм, существующими во всех биофлюидных и клеточных культурных средствах массовой информации. Для дальнейшего изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе терапии SCE и определить действия экзосом, выпущенных из CB-SC, мы исследуем, какие клетки фагоцитизируют эти экзосомы во время лечения CB-SC. По совместной культивирования Дио помечены CB-SC полученных экзосом с человеческой периферической крови моноядерных клеток (PBMC), мы обнаружили, что CB-SC полученных экзосом были преимущественно приняты человека CD14-положительных моноцитов, что приводит к дифференциации моноцитов в тип 2 макрофаги (M2), с шпиндель-как морфология и выражение M2-ассоциированных молекулярных маркеров. Здесь мы представляем протокол для изоляции и характеристики экзосом, полученных CB-SC, и протокол для совместной культуры экзосом, полученных CB-SC, с моноцитами человека и мониторинга дифференциации M2.
Introduction
Стволовые клетки пуповинной крови (CB-SC) являются уникальным типом стволовых клеток, идентифицированных из пуповинной крови человека и отличаются от других известных типов стволовых клеток, таких как мезенхимальные стволовые клетки (MSC) и гематопоэтические стволовые клетки (HSC)1. Основываясь на их уникальных свойствах иммунной модуляции и их способности плотно прилипать к поверхности чашек Петри, мы разработали новую технологию, обозначенную как терапия стволовыми клетками (SCE) в клиническихиспытаниях 2,3. Во время терапии SCE, периферические моноядерные клетки крови пациента (PBMC) собираются и циркулируют через клеточный сепаратор и совместно культурируются с приверженцем CB-SC in vitro. Эти “образованные” клетки (CB-SC-обработанные PBMC) затем возвращаются в кровообращение пациента в замкнутой системе. Клинические испытания уже продемонстрировали клиническую безопасность и эффективность терапии SCE для лечения аутоиммунных заболеваний, включая диабет типа 1 (T1D)2,4 и алопеция areata (AA)5.
Экзосомы являются семейство наночастиц диаметром от 30 до 2012150 нм и существуют во всех биофлюидных и клеточных культурСМИ 6. Экзосомы обогащаются многими биологически неактивными молекулами, включая липиды, мРНК, белки и микроРНК (миРНК), и играют важную роль в связи между клетками. В последнее время экзосомы стали более привлекательными для исследователей и фармацевтических компаний из-за их терапевтическогопотенциала в клиниках 7,8,9. Недавно наши механистические исследования показали, что CB-SC-выпущенные экзосомы способствуют иммунной модуляции SCE терапии10.
Здесь мы описываем протокол для изучения механизма SCE терапии ориентации моноцитов CB-SC-выпущенных экзосом. Во-первых, выпущенные CB-SC экзосомы были изолированы от кондиционированных средств массовой информации CB-SC с использованием методов ультрацентрифугации и проверены цитометрией потока, западной помаркой (WB) и динамическим рассеянием света (DLS). Во-вторых, экзосомы, полученные из CB-SC, были помечены зеленым флуоресцентным липофильным красителем: Dio. В-третьих, они были совместно культурированы с PBMC для изучения положительных процентов дио помечены CB-SC полученных экзосом на различных субпопуляций ПБМК по цитометрии потока. Этот протокол содержит рекомендации по изучению действия экзосом, лежащих в основе иммунной модуляции стволовых клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Применение экзосом является новой областью для клинической диагностики, разработки лекарств и регенеративной медицины. Здесь мы представляем подробный протокол о подготовке экзосом, полученных из CB-SC, и функциональное исследование экзосом на дифференциацию моноцитов человека. Текущ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признательны г-ну Поддару и г-ну Людвигу за щедрую финансовую поддержку через Фонд UMC Хакенсака. Мы ценим Лауру Чжао за редактирование английского языка.
Materials
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. . Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).
