Summary

Monositlerin İnsan Kordon Kan Kök Hücresi (CB-SC)-Türetilmiş Ekzozomlar Ile Tedavi Sonrası Fenotipik Farklı Makrofajlara Farklılaşması

Published: November 12, 2020
doi:

Summary

Ekzozom uygulaması ilaç geliştirme ve rejeneratif tıp için ortaya çıkan bir araçtır. Mekanistik çalışmalar için CB-SC adı verilen yeni tanımlanmış kök hücrelerden ekzozomları izole etmek için yüksek saflıkta bir ekzozom izolasyon protokolü uyguluyoruz. Ayrıca insan monositleri ile CB-SC kaynaklı ekzozomlar, fenotipik farklı makrofajlar içine farklılaşmayol eşkültür.

Abstract

Kök Hücre Eğitimcisi (SCE) tedavisi tip 1 diyabet ve diğer otoimmün hastalıkların tedavisinde yeni bir klinik yaklaşımdır. SCE tedavisi izole hastanın kan mononükleer hücreleri (örneğin, lenfositler ve monositler) bir aferez makinesi aracılığıyla dolaşır, eş-kültürler hastanın kan mononükleer hücreleri yapışık kordon kanı kaynaklı kök hücreleri ile (CB-SC) SCE cihaz, ve daha sonra hastanın kan bu “eğitimli” bağışıklık hücreleri döndürür. Ekzozomlar tüm biyosıvı ve hücre kültürü ortamlarında bulunan 30\u2012150 nm arasında nano boyutlu ekstrasellüler veziküllerdir. SCE tedavisinin altında yatan moleküler mekanizmaları daha fazla araştırmak ve CB-SC’den salınan ekzozomların hareketlerini belirlemek için, CB-SC ile tedavi sırasında hangi hücrelerin bu ekzozomları fagositize olduğunu araştırıyoruz. Dio-SC kaynaklı ekzozomları insan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) ile birlikte örerek, CB-SC türetilmiş ekzozomların ağırlıklı olarak insan CD14-pozitif monositler tarafından alındığını ve monositlerin tip 2 makrofajlara (M2) farklılaşmasına yol açarak, mil benzeri morfolojisi ve M2 ile ilişkili yüzey lerinin ifadesinin alındığını bulduk. Burada CB-SC kaynaklı ekzozomların izolasyonu ve karakterizasyonu için bir protokol ve CB-SC kaynaklı ekzozomların insan monositleri ile birlikte kültürü ve M2 farklılaşmasının izlenmesi için protokol saklı yız.

Introduction

Kordon kanı kök hücreleri (CB-SC) insan kordon kanı ndan tanımlanan kök hücrelerin benzersiz türüdür ve mezenkimal kök hücreler (MSC) ve hematopoetik kök hücreler (HSC)1gibi kök hücrelerin diğer bilinen tiplerinden ayırt edilir. Bağışıklık modülasyonu ve sıkıca Petri yemekleri yüzeyine uymak için yeteneklerini kendi benzersiz özellikleri dayanarak, biz klinik çalışmalarda Kök Hücre Eğitimci (SCE) tedavisi olarak belirlenen yeni bir teknoloji geliştirdi2,3. SCE tedavisi sırasında hastanın periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) toplanır ve bir hücre ayırıcısı aracılığıyla dolaşıma sokularak yapışık CB-SC in vitro ile birlikte kültürlenir. Bu “eğitimli” hücreler (CB-SC-tedavi PBMC) daha sonra kapalı döngü sistemi içinde hastanın dolaşımına döndürülür. Klinik çalışmalar zaten tip 1 diyabet (T1D)2,4 ve alopesi areata (AA)5dahil olmak üzere otoimmün hastalıkların tedavisi için SCE tedavisinin klinik güvenlik ve etkinliğini göstermiştir .

Ekzozomlar çapları 30\u2012150 nm arasında değişen nano tanecikleri bir aile ve tüm biyoakışkan ve hücre kültürü medya6var. Ekzozomlar lipidler, mRNA’lar, proteinler ve mikroRNA’lar (miRNA) dahil olmak üzere birçok biyoaktif molekülle zenginleşir ve hücre-hücre iletişiminde önemli bir rol oynarlar. Geç, ekzozomlar kliniklerde tedavi potansiyelleri nedeniyle araştırmacılar ve ilaç şirketleri için daha cazip hale gelmiştir7,8,9. Son zamanlarda, bizim mekanistik çalışmalar CB-SC yayımlanan ekzozomlar SCE tedavisinin bağışıklık modülasyonu katkıda gösterdi10.

Burada, CB-SC’de serbest bırakılan ekzozomlar tarafından monositleri hedefleyen SCE tedavisinin mekanizmasını araştırmak için protokolü açıklıyoruz. İlk olarak, CB-SC’den serbest bırakılan ekzozomlar ultrasantrifüj yöntemleri kullanılarak CB-SC kaynaklı klimalı ortamdan izole edildi ve akış sitometrisi, western blot (WB) ve dinamik ışık saçılımı (DLS) ile doğrulandı. İkinci olarak, CB-SC türetilmiş ekzozomlar yeşil floresan lipophilic boya ile etiketlendi: Dio. Üçüncü olarak, akış sitometrisi ile PBMC’nin farklı alt popülasyonlarında Dio etiketli CB-SC türetilmiş ekzozomların pozitif yüzdelerini incelemek için PBMC ile birlikte kültürlendiler. Bu protokol, kök hücrelerin immün modülasyonunun altında yatan ekzozomların eylemini incelemek için rehberlik sağlar.

Protocol

Protokol, Hackensack Meridian Health Discovery and Innovation Merkezi’ndeki kurumsal insan araştırma etik komitesinin yönergelerini takip eder. İnsan buffy ceket kan birimleri New York Kan Merkezi (New York, NY) satın alındı. İnsan göbek kordon kan üniteleri sağlıklı donörlerden toplandı ve Cryo-Cell International kan bankasından (Oldsmar, FL) satın alındı. Hem New York Kan Merkezi hem de Cryo-Cell kan toplama ve dağıtımları için tüm akreditasyonları, IRB onayı ve bağışçılardan imzalı Ona…

Representative Results

Başlangıçta CB-SC’nin fenotip ve saflığı lökosit ortak antijen CD45, ES hücreye özgü transkripsiyon faktörleri OCT3/4 ve SOX2 gibi CB-SC ile ilişkili belirteçlerle akış sitometrisi ile incelendi. CB-SC yüksek düzeyde CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 ve galectin 9 ekspresyonu gösterir, ancak CD34’ün ifadesi yoktur(Şekil 1A). Akış sitometri analizi, CD9, CD81 ve CD63 gibi ekzozomspesifik belirteçlerin EKSPRESYONUNU DOĞRULADI (Şekil 1B). Ekzozomla…

Discussion

Ekzozomların uygulanması klinik tanı, ilaç gelişmeleri ve rejeneratif tıp için ortaya çıkan bir alandır. Burada CB-SC türetilmiş ekzozomların hazırlanması ve insan monositlerinin farklılaşması üzerine ekzozomların fonksiyonel çalışması ile ilgili ayrıntılı bir protokol saklıyız. Mevcut protokol, fonksiyonel CB-SC türetilmiş ekzozomların sıralı santrifüj ve yüksek saflıkta ultrasantrifüj ile izole olduğunu ve monositler üzerinde immün modülasyon sergilediğini göstermiştir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz Hackensack UMC Vakfı aracılığıyla cömert finansman desteği için Bay Poddar ve Bay Ludwig için müteşekkiriz. Biz İngilizce düzenleme için Laura Zhao için teşekkür ederiz.

Materials

1.5 ml Microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-129
15 ml conical tube Falcon 352196
24-well plate Falcon 351147 Non-tissue culture
plate
3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) Millipore sigma D4292-20MG Store at 4 °C
300 Mesh Grids Ted Pella 1GC300
50 mL conical tube Falcon 352070
6-well plate Falcon 353046 Tissue culture plate
96-well plate Falcon 353072 Tissue culture plate
ACK Lysis Buffer Lonza 10-548E 100 ml
Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit Millipore sigma UFC901024
Anti-Human Alix Biolegend 634501 store at 4 °C, RRID: AB_2268110
Anti-Human Calnexin Biolegend 699401 store at 4 °C, RRID: AB_2728519
Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 BD Bioscience 561356 store at 4 °C, RRID: AB_10611859
Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange Beckman Coulter B36294 store at 4 °C, RRID: AB_2728099
Anti-Human CD163 antibody, PE BD Bioscience 556018 store at 4 °C, RRID: AB_396296
Anti-Human CD19 antibody, PC5 Beckman Coulter IM2643U store at 4 °C, RRID: AB_131160
Anti-Human CD206 antibody, FITC BD Bioscience 551135 store at 4 °C, RRID: AB_394065
Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 BD Bioscience 564127 store at 4 °C, RRID: AB_2738610
Anti-Human CD270 antibody, PE Biolegend 318806 store at 4 °C, RRID: AB_2203703
Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue Biolegend 300431 store at 4 °C, RRID: AB_1595437
Anti-Human CD34 antibody, APC Beckman Coulter IM2427U store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD4 antibody, APC BD Bioscience 555349 store at 4 °C, RRID: AB_398593
Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 Beckman Coulter IM3548U store at 4 °C, RRID: AB_1575969
Anti-Human CD56 antibody, PE Beckman Coulter IM2073U store at 4 °C, RRID: AB_131195
Anti-Human CD63 antibody,PE BD Bioscience 561925 store at 4 °C, RRID: AB_10896821
Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 Beckman Coulter A94686 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD80 antibody, APC Beckman Coulter B30642 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD81 antibody, FITC BD Bioscience 561956 store at 4 °C, RRID: AB_394049
Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 Beckman Coulter B30646 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD9 antibody, FITC ThermoScientic MA5-16860 store at 4 °C, RRID: AB_2538339
Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 Biolegend 348919 store at 4 °C, RRID: AB_2716134
Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 ThermoScientic 50-5841-82 store at 4 °C, RRID: AB_11218882
Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 ThermoScientic 53-9811-82 store at 4 °C, RRID: AB_2574479
BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A1933
Buffy coat New York Blood Center 40-60 ml/unit
Cell scraper Falcon 353085
Disposable semi-micro cuvette VWR 97000590
Dissociation buffer Gibco 131510014 100 ml
Dual-Chanber cell counting slides Bio-Rad 1450015
Exosome-Human CD63 Detection reagent ThermoFisher Scientific 10606D store at 4 °C
Ficoll-Paque PLUS density grandient media GE Health 17-1440-03 500 ml
Fixed-Angle Rotor(25°) Thermo Scientifc 75003698 Maxium 24,700 x g
Gallios flow cytometer Beckman Coulter 3 lasers
10 Color Max
Human cord blood Cryo-Cell International 40-100 ml/unit
Human Fc Block BD Bioscience 564220 store at 4 °C
Immun-Blot PVDF membrane Bio-Rad 1620177
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore Sigma SLGP033RS
Optima XE-90 Ultracentriguge Beckman Coulter
Orbital Shaker MP4 BioExpress S-3500-1
PBS ThermoFisher Scientific 10010049 500 ml
Propidium Iodide BD Bioscience 56-66211E store at 4 °C
Nikon Eclipse Ti2 microscope Nikon instruments Inc Eclipse Ti2 NIS-Elements software version 5.11.02
Hochest 33342 Thermo Scientifc 62249 5 ml
Revert microsopy Fisher scientific 12563518
Rotor 41 Ti Beckman Coulter 331362 Maxium 41,000 rpm
Sorvall St 16R Centrifuge Thermo Scientifc 75004381
Swinging Bucket Rotor Thermo Scientifc 75003655
TC-20 cell counter Bio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator ThermoFisher Scientific
Transmission electron microscopy JEOL JEM-2100 PLUS
Ultracentrifuge tube Beckman Coulter 331372
X'VIVO 15 Serum-free medium Lonza BEBP04-744Q 1000 ml Culture medium, store at 4 °C

References

  1. Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
  2. Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
  3. Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
  4. Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
  5. Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87 (2015).
  6. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  7. Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
  8. Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
  9. Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
  10. Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
  11. Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
  12. Dykstra, M. J., Reuss, L. E. . Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).
  13. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  15. Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).

Play Video

Cite This Article
Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes. J. Vis. Exp. (165), e61562, doi:10.3791/61562 (2020).

View Video