Summary

Differenziazione dei monociti in macrofagi fenotipicamente distinti dopo il trattamento con esosomi derivati dalle cellule staminali del sangue del cordone ombelicale umano (CB-SC)

Published: November 12, 2020
doi:

Summary

L’applicazione esosoma è uno strumento emergente per lo sviluppo di farmaci e la medicina rigenerativa. Stabiliamo un protocollo di isolamento esosoma ad alta purezza per isolare gli esosomi dalle nuove cellule staminali identificate chiamate CB-SC per studi meccanicistici. Cocoliamo anche esosomi derivati dal CB-SC con monociti umani, portando alla loro differenziazione in macrofagi fenotipicamente distinti.

Abstract

La terapia con educatore di cellule staminali (SCE) è un nuovo approccio clinico per il trattamento del diabete di tipo 1 e di altre malattie autoimmuni. La terapia SCE fa circolare le cellule mononucleari del sangue del paziente isolato (ad esempio linfociti e monociti) attraverso una macchina di aferesi, co-coltura le cellule mononucleari del sangue del paziente con cellule staminali derivate dal sangue del cordone ombelicale aderenti (CB-SC) nel dispositivo SCE, quindi restituisce queste cellule immunitarie “istruite” al sangue del paziente. Gli esosomi sono vescicole extracellulari di dimensioni nanometriche tra 30\u2012150 nm esistenti in tutti i mezzi di coltura biofluida e cellulare. Per esplorare ulteriormente i meccanismi molecolari alla base della terapia SCE e determinare le azioni degli esosomi rilasciati da CB-SC, studiamo quali cellule fagocitizzano questi esosomi durante il trattamento con CB-SC. Co-coltivando esosomi derivati dal CB-SC con cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMC), abbiamo scoperto che gli esosomi derivati dal CB-SC sono stati prevalentemente ripresi da monociti positivi al CD14 umano, portando alla differenziazione dei monociti nei macrofagi di tipo 2 (M2), con morfologia simile al mandrino ed espressione dei marcatori molecolari superficiali associati all’M2. Qui presentiamo un protocollo per l’isolamento e la caratterizzazione degli esosomi derivati da CB-SC e il protocollo per la co-coltura di esosomi derivati da CB-SC con monociti umani e il monitoraggio della differenziazione M2.

Introduction

Le cellule staminali del sangue del cordone ombelicale (CB-SC) sono un tipo unico di cellule staminali identificate dal sangue del cordone ombelicale umano e si distinguono da altri tipi noti di cellule staminali come le cellule staminali mesenchimali (MSC) e le cellule staminali ematopoietiche (HSC)1. Sulla base delle loro proprietà uniche di modulazione immunitaria e della loro capacità di aderire strettamente alla superficie delle piastre di Petri, abbiamo sviluppato una nuova tecnologia designata come terapia di educatore delle cellule staminali (SCE) negli studiclinici 2,3. Durante la terapia SCE, le cellule mononucleari del sangue periferico di un paziente (PBMC) vengono raccolte e circolate attraverso un separatore cellulare e co-coltivate con CB-SC aderente in vitro. Queste cellule “istruite” (PBMC trattato con CB-SC) vengono quindi restituite alla circolazione del paziente in un sistema a circuito chiuso. Studi clinici hanno già dimostrato la sicurezza clinica e l’efficacia della terapia SCE per il trattamento di malattie autoimmuni tra cui diabete di tipo 1 (T1D)2,4 e alopecia areata (AA)5.

Gli esosomi sono una famiglia di nanoparticelle con diametri che vanno da 30\u2012150 nm ed esistono in tutti i mezzi di coltura biofluida ecellulare 6. Gli esosomi sono arricchiti con molte molecole bioattive tra cui lipidi, mRNA, proteine e microRNA (miRNA) e svolgono un ruolo importante nelle comunicazioni da cellula a cellula. Negli ultimi tempi, gli esosomi sono diventati più attraenti per i ricercatori e le aziende farmaceutiche a causa delle loro potenzialità terapeutiche nellecliniche 7,8,9. Recentemente, i nostri studi meccanicistici hanno dimostrato che gli esosomi rilasciati da CB-SC contribuiscono alla modulazione immunitaria della terapia SCE10.

Qui descriviamo il protocollo per esplorare il meccanismo della terapia SCE che prende di mira i monociti da esosomi rilasciati da CB-SC. In primo luogo, gli esosomi rilasciati dal CB-SC sono stati isolati dai supporti condizionati derivati da CB-SC utilizzando metodi di ultracentrifugazione e convalidati dalla citometria del flusso, dalla western blot (WB) e dalla diffusione dinamica della luce (DLS). In secondo luogo, gli esosomi derivati dal CB-SC sono stati etichettati con un colorante lipofilo fluorescente verde: Dio. In terzo luogo, sono stati co-coltivati con PBMC per esaminare le percentuali positive di esosomi derivati da CB-SC con etichetta Dio alle diverse sottopopolazioni di PBMC per citometria a flusso. Questo protocollo fornisce indicazioni per studiare l’azione degli esosomi alla base della modulazione immunitaria delle cellule staminali.

Protocol

Il protocollo segue le linee guida del comitato etico istituzionale per la ricerca umana presso Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Le unità di sangue del mantello buffy umano sono state acquistate dal New York Blood Center (New York, NY). Le unità di sangue del cordone ombelicale umano sono state raccolte da donatori sani e acquistate dalla banca del sangue Cryo-Cell International (Oldsmar, FL). Sia il New York Blood Center che Cryo-Cell hanno ricevuto tutti gli accreditamenti per le racco…

Representative Results

Inizialmente, il fenotipo e la purezza del CB-SC sono stati esaminati dalla citometria del flusso con marcatori associati al CB-SC come il leucocitario comune antigene CD45, i fattori di trascrizione specifici delle cellule ES OCT3/4 e SOX2. CB-SC visualizza alti livelli di espressione CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 e galectin 9, ma nessuna espressione di CD34 (Figura 1A). L’analisi della citometria a flusso ha confermato l’espressione di marcatori specifici dell’esosoma, inclusi CD9, CD81 e CD63…

Discussion

L’applicazione di esosomi è un campo emergente per la diagnosi clinica, lo sviluppo di farmaci e la medicina rigenerativa. Qui presentiamo un protocollo dettagliato riguardante la preparazione di esosomi derivati dal CB-SC e lo studio funzionale degli esosomi sulla differenziazione dei monociti umani. L’attuale protocollo ha dimostrato che gli esosomi funzionali derivati da CB-SC sono isolati dalla centrifugazione sequenziale e dall’ultracentrifugazione con elevata purezza ed espongono la modulazione immunitaria sui mon…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati a Poddar e Ludwig per il generoso sostegno finanziario tramite la Hackensack UMC Foundation. Apprezziamo Laura Zhao per l’editing in inglese.

Materials

1.5 ml Microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-129
15 ml conical tube Falcon 352196
24-well plate Falcon 351147 Non-tissue culture
plate
3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) Millipore sigma D4292-20MG Store at 4 °C
300 Mesh Grids Ted Pella 1GC300
50 mL conical tube Falcon 352070
6-well plate Falcon 353046 Tissue culture plate
96-well plate Falcon 353072 Tissue culture plate
ACK Lysis Buffer Lonza 10-548E 100 ml
Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit Millipore sigma UFC901024
Anti-Human Alix Biolegend 634501 store at 4 °C, RRID: AB_2268110
Anti-Human Calnexin Biolegend 699401 store at 4 °C, RRID: AB_2728519
Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 BD Bioscience 561356 store at 4 °C, RRID: AB_10611859
Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange Beckman Coulter B36294 store at 4 °C, RRID: AB_2728099
Anti-Human CD163 antibody, PE BD Bioscience 556018 store at 4 °C, RRID: AB_396296
Anti-Human CD19 antibody, PC5 Beckman Coulter IM2643U store at 4 °C, RRID: AB_131160
Anti-Human CD206 antibody, FITC BD Bioscience 551135 store at 4 °C, RRID: AB_394065
Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 BD Bioscience 564127 store at 4 °C, RRID: AB_2738610
Anti-Human CD270 antibody, PE Biolegend 318806 store at 4 °C, RRID: AB_2203703
Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue Biolegend 300431 store at 4 °C, RRID: AB_1595437
Anti-Human CD34 antibody, APC Beckman Coulter IM2427U store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD4 antibody, APC BD Bioscience 555349 store at 4 °C, RRID: AB_398593
Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 Beckman Coulter IM3548U store at 4 °C, RRID: AB_1575969
Anti-Human CD56 antibody, PE Beckman Coulter IM2073U store at 4 °C, RRID: AB_131195
Anti-Human CD63 antibody,PE BD Bioscience 561925 store at 4 °C, RRID: AB_10896821
Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 Beckman Coulter A94686 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD80 antibody, APC Beckman Coulter B30642 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD81 antibody, FITC BD Bioscience 561956 store at 4 °C, RRID: AB_394049
Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 Beckman Coulter B30646 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD9 antibody, FITC ThermoScientic MA5-16860 store at 4 °C, RRID: AB_2538339
Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 Biolegend 348919 store at 4 °C, RRID: AB_2716134
Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 ThermoScientic 50-5841-82 store at 4 °C, RRID: AB_11218882
Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 ThermoScientic 53-9811-82 store at 4 °C, RRID: AB_2574479
BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A1933
Buffy coat New York Blood Center 40-60 ml/unit
Cell scraper Falcon 353085
Disposable semi-micro cuvette VWR 97000590
Dissociation buffer Gibco 131510014 100 ml
Dual-Chanber cell counting slides Bio-Rad 1450015
Exosome-Human CD63 Detection reagent ThermoFisher Scientific 10606D store at 4 °C
Ficoll-Paque PLUS density grandient media GE Health 17-1440-03 500 ml
Fixed-Angle Rotor(25°) Thermo Scientifc 75003698 Maxium 24,700 x g
Gallios flow cytometer Beckman Coulter 3 lasers
10 Color Max
Human cord blood Cryo-Cell International 40-100 ml/unit
Human Fc Block BD Bioscience 564220 store at 4 °C
Immun-Blot PVDF membrane Bio-Rad 1620177
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore Sigma SLGP033RS
Optima XE-90 Ultracentriguge Beckman Coulter
Orbital Shaker MP4 BioExpress S-3500-1
PBS ThermoFisher Scientific 10010049 500 ml
Propidium Iodide BD Bioscience 56-66211E store at 4 °C
Nikon Eclipse Ti2 microscope Nikon instruments Inc Eclipse Ti2 NIS-Elements software version 5.11.02
Hochest 33342 Thermo Scientifc 62249 5 ml
Revert microsopy Fisher scientific 12563518
Rotor 41 Ti Beckman Coulter 331362 Maxium 41,000 rpm
Sorvall St 16R Centrifuge Thermo Scientifc 75004381
Swinging Bucket Rotor Thermo Scientifc 75003655
TC-20 cell counter Bio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator ThermoFisher Scientific
Transmission electron microscopy JEOL JEM-2100 PLUS
Ultracentrifuge tube Beckman Coulter 331372
X'VIVO 15 Serum-free medium Lonza BEBP04-744Q 1000 ml Culture medium, store at 4 °C

References

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Cite This Article
Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes. J. Vis. Exp. (165), e61562, doi:10.3791/61562 (2020).

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