בידול של מונוציטים לתוך מקרופאגים שונים Phenotypically לאחר טיפול עם תאי גזע דם חוט אנושי (CB-SC)נגזר אקסוזומים
Summary
יישום Exosome הוא כלי מתפתח לפיתוח תרופות ורפואה רגנרטיבית. אנו מקימים פרוטוקול בידוד אקסו-זמני עם טוהר גבוה כדי לבודד אקסוזומים מתאי גזע שזוהו על ידי רומן הנקראים CB-SC למחקרים מכניים. אנחנו גם coculture CB-SC נגזר אקסוזומים עם מונוציטים אנושיים, המוביל ההבדל שלהם לתוך מקרופאגים שונים phenotypically.
Abstract
טיפול במחנך תאי גזע (SCE) הוא גישה קלינית חדשנית לטיפול בסוכרת מסוג 1 ובמחלות אוטואימוניות אחרות. טיפול SCE מפיץ את תאי הדם החד-גרעיניים של המטופל המבודד (למשל, לימפוציטים ומונוציטים) באמצעות מכונת אפיה, תרבויות ותרביות תרבית הדם של המטופל mononuclear תאים עם תאי גזע טבור דבקים (CB-SC) במכשיר SCE, ולאחר מכן מחזיר תאים חיסוניים “משכילים” אלה לדם של המטופל. Exosomes הם שלל חוץ תאי בגודל ננו בין 30\u2012150 ננומטר קיים בכל מדיה ביו-נוזלים ותרבות תא. כדי להמשיך לחקור מנגנונים מולקולריים הבסיסיים טיפול SCE ולקבוע את הפעולות של exosomes שוחרר CB-SC, אנו חוקרים אילו תאים phagocytize אלה exosomes במהלך הטיפול עם CB-SC. על-ידי שיתוף culturing CB-SC-נגזר אקסוזומים עם תאים חד גרעיניים דם היקפיים אנושיים (PBMC), מצאנו כי exosomes נגזר CB-SC נלקחו בעיקר על ידי מונוציטים אנושיים CD14 חיובי, המוביל הבידול של מונוציטים לתוך סוג 2 מקרופאגים (M2), עם מורפולוגיה דמויי ציר וביטוי של סמנים מולקולריים משטח M2 הקשורים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ואפיון של אקסוזומים הנגזרים מ-CB-SC ולפרוטוקול לתרבות ההפוכחה של אקסוזומים שמקורם ב-CB-SC עם מונוציטים אנושיים וניטור בידול M2.
Introduction
תאי גזע דם טבורים (CB-SC) הם סוג ייחודי של תאי גזע המזוהים מדם טבור אנושי ומובדלים מסוגים ידועים אחרים של תאי גזע כגון תאי גזע mesenchymal (MSC) ותאי גזע hematopoietic (HSC)1. בהתבסס על המאפיינים הייחודיים שלהם של אפנון חיסוני והיכולת שלהם לדבוק בחוזקה על פני השטח של צחות פטרי, פיתחנו טכנולוגיה חדשה המוגדרת כטיפול מחנך תאי גזע (SCE) בניסוייםקליניים 2,3. במהלך טיפול SCE, תאים חד-גרעיניים בדם היקפי של המטופל (PBMC) נאספים ומופצים דרך מפריד תאים ויתורות בהתרבות עם CB-SC דבק במבחנה. תאים “משכילים” אלה (PBMC שטופלו ב-CB-SC) מוחזרים לאחר מכן למחזור הדם של המטופל במערכת סגורה. ניסויים קליניים כבר הוכיחו את הבטיחות הקלינית ואת היעילות של טיפול SCE לטיפול במחלות אוטואימוניות כולל סוכרת סוג 1 (T1D)2,4 והתקרחות areata (AA)5.
Exosomes הם משפחה של חלקיקים עם קטרים הנעים 30\u2012150 nm והם קיימים בכל biofluid ומדיה תרבות תא6. אקסוזומים מועשרים מולקולות ביואקטיביות רבות כולל שומנים, mRNAs, חלבונים, microRNAs (miRNA), ולשחק תפקיד חשוב בתקשורת תא לתא. לאחרונה, exosomes הפכו אטרקטיביים יותר עבור חוקרים וחברות תרופות בשל הפוטנציאל הטיפולי שלהםבמרפאות 7,8,9. לאחרונה, המחקרים המכניים שלנו הראו כי exosomes CB-SC שפורסמו לתרום אפנון חיסוני של טיפול SCE10.
כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לחקור את המנגנון של טיפול SCE מיקוד מונוציטים על ידי exosomes CB-SC שפורסמו. ראשית, exosomes CB-SC שוחררו היו מבודדים מ CB-SC נגזר מדיה מותנית באמצעות שיטות ultracentrifugation ואומתו על ידי ציטומטריה זרימה, כתם מערבי (WB) ופיזור אור דינמי (DLS). שנית, אקסוזומים נגזר CB-SC סומנו עם צבע ליפופילי פלורסנט ירוק: דיו. שלישית, הם היו שיתוף תרבות עם PBMC כדי לבחון את האחוזים החיוביים של exosomes CB-SC-מתויג בתת-אוכלוסיות שונות של PBMC על ידי ציטומטריית זרימה. פרוטוקול זה מספק הדרכה ללמוד את הפעולה של exosomes הבסיסית אפנון חיסוני של תאי גזע.
Protocol
Representative Results
Discussion
יישום אקסוזומים הוא תחום מתפתח לאבחון קליני, פיתוחים תרופתיים ורפואה רגנרטיבית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לגבי הכנת exosomes CB-SC נגזר והמחקר הפונקציונלי של exosomes על ההבידול של מונוציטים אנושיים. הפרוטוקול הנוכחי הוכיח כי exosomes CB-SC פונקציונלי נגזר מבודדים על ידי צנטריפוגה רציף ultracentrifugation ע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה למר פודדר ולמר לודוויג על תמיכה נדיבה במימון באמצעות קרן האקנסק UMC. אנו מעריכים את לורה זאו לעריכה אנגלית.
Materials
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. . Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).
