Mouse Retinal Pigment Epitelinin Işık Uyarılmış Elektriksel Tepkilerini Kaydetmek için Doğrudan Birleştirilmiş Elektroretinogram (DC-ERG)
Summary
Burada, ilk olarak Marmorstein, Peachey ve meslektaşları tarafından 2000’li yılların başında tanımlanan DC-ERGs olarak bilinen bir tekniği kullanarak farelerde retina pigment epitelinin (RPE) ışık uyarılmış elektriksel tepkilerini kaydetmek için bir yöntem saklı tutuyoruz.
Abstract
Retina pigmentepiteli (RPE), fotoreseptörlerin genel sağlığını ve yapısal bütünlüğünü koruyan retina ve korokapiller arasında stratejik olarak bulunan özel bir tek hücre katmanıdır. RPE polarize, apically ve bazal bulunan reseptörleri veya kanalları sergileyen, ve su vektörel taşıma gerçekleştirir, iyonlar, metabolitler, ve çeşitli sitokinler salgılar.
RPE fonksiyonunun in vivo noninvaziv ölçümleri doğrudan birleşen ERG’ler (DC-ERGs) kullanılarak yapılabilir. DC-ERG arkasındaki metodoloji Marmorstein, Peachey ve meslektaşları tarafından özel olarak inşa edilmiş bir stimülasyon kayıt sistemi kullanılarak öncülük edildi ve daha sonra ticari olarak kullanılabilir bir sistem kullanılarak gösterdi. DC-ERG tekniği, fotoreseptör aktivitesi nedeniyle alt retinal alandaki ışık uyarılmış konsantrasyon değişikliklerinden kaynaklanan RPE’nin yavaş elektriksel tepkilerini ölçmek için Hank’in tamponlu tuz çözeltisi (HBSS) ile dolu cam kılcal damarlar kullanır. Dc-ERG kaydının uzun süreli ışık uyaranları ve uzunluğu, onu sürüklenmeye ve gürültüye karşı savunmasız hale getirerek kullanılabilir kayıtların düşük verimine neden olur. Burada, HBSS ve elektrot tutucunun gaz dan kaynaklanan kabarcıkları azaltmak/ortadan kaldırmak için vakum basıncı nı kullanarak gürültüyü azaltırken kayıtların stabilitesini artırmak için hızlı ve güvenilir bir yöntem salıyoruz. Ayrıca, güç hattı eserler bir voltaj regülatörü / güç kremi kullanılarak zayıflatılır. Ticari olarak kullanılabilen bir ERG sistemi için gerekli ışık stimülasyon protokollerini ve DC-ERG bileşenlerinin analizi için komut dosyalarını içeririz: c-dalgası, hızlı salınım, ışık tepe ve kapalı yanıt. Kayıtların kolaylığı ve hızlı analiz iş akışı nedeniyle, bu basitleştirilmiş protokol özellikle RPE fonksiyonunda yaşa bağlı değişikliklerin ölçülmesinde, hastalığın ilerlemesinde ve farmakolojik müdahalenin değerlendirilmesinde yararlıdır.
Introduction
Retina pigment epitel (RPE) gözün arka segmentinde çizgi ve retinahomestaz korumak için kritik fonksiyonlar uygulamak özel hücrelerin bir monolayerolduğunu 1. RPE görseldöngü2 denilen bir süreç içinde foton yakalama görsel pigment rejenerasyon tarafından fotoreseptörleri destekler , dış segment ipuçları döken diurnal fagositoz katılarak3, ve fotoreseptörler ve koryokapiller arasında besin ve metabolik ürünlerin taşınmasında 4,5. RPE fonksiyonundaki anormallikler yaşa bağlı makula dejenerasyonu6,Leber’in konjenital amaurosis7,8 ve En İyi vitelliform makula distrofisi9gibi çok sayıda insan retinası hastalığının altında yatan. Donör göz dokuları genellikle araştırma amaçlı sadece elde etmek zor olduğundan, genetik modifikasyonlar ile hayvan modelleri retina hastalıklarının gelişimini incelemek için alternatif bir yol sağlayabilir10,11. Ayrıca, CRISPR cas9 teknolojisinin ortaya çıkması ve uygulanması artık genomik tanıtımlara (knock-in) veya silmelere (knock-out) önceki gen hedefleme teknolojilerinin sınırlamalarını aşan basit, tek adımlı bir süreçte izin vermektedir12. Yeni fare modelleri13 kullanılabilirliği patlama non-invaziv RPE işlevini değerlendirmek için daha verimli bir kayıt protokolü gerektirir.
RPE’nin ışık uyarılmış elektriksel tepkilerinin ölçümü doğrudan birleştirilmiş elektroretinogram (DC-ERG) tekniği ile sağlanabilir. Fotoreseptör (a-dalga) ve bipolar (b-dalga) hücre yanıtlarını ölçen geleneksel ERG kayıtları ile birlikte kullanıldığında14, DC-ERG retinadejenerasyon15ile RPE değişim nasıl tanımlayabilirsiniz,16,17 veya RPE disfonksiyonu fotoreseptör kaybı öncesinde olup olmadığını. Bu protokol, Marmorstein, Peachey ve ilk DC-ERG tekniği 16 ,18,19,20 geliştirilen meslektaşlarının çalışmalarından uyarlanmış bir yöntem açıklar ve tekrarlanabilirlik ve kullanım kolaylığı üzerine geliştirir.
DC-ERG kaydının, herhangi bir kesintinin veya gürültünün tanıtılmasının verilerin yorumlanmasını zorlaştırabileceği uzun satın alma süresi (9 dk) nedeniyle gerçekleşme zordur. Bu yeni yöntemin avantajı, taban çizgilerinin hayvanın anesteziden erken uyanma olasılığını azaltarak ve kılcal elektrotlarda kabarcık oluşumuna daha az yatkın olma olasılığını azaltarak daha kısa bir süre içinde sabit bir duruma ulaşmasıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritik Adımlar
İyi bir DC-ERG kaydı, gaz giderme ve sıcaklık değişikliklerine karşı son derece hassas oldukları için, artefakt ve istenmeyen sürüklenme yaratan kabarcıklardan arınmış kararlı elektrotlar gerektirir. Fare kaydıyla ilerlemeden önce elektrotlar HBSS banyo çözeltisine yerleştirildiğinde kararlı bir taban çizgisine ulaşılması esastır. Küçük kabarcıklar kılcal elektrot tabanında veya silikon conta etrafında toplamak eğilimindedir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NEI intramural fonlar tarafından desteklenmiştir. Yazarlar içtenlikle onun bilimsel rehberlik, teknik tavsiye ve RPE fizyolojisi ve hastalığı uzmanlığı için Dr Sheldon Miller kabul. Yazarlar Megan Kopera ve fare kolonileri yönetmek için hayvan bakım personeli teşekkür ve Dr Tarun Bansal, Raymond Zhou, ve Yuan Wang teknik destek için.
Materials
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| Matlab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| needle (ground) electrode | Rhythmlink | 13mm – one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
- Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
- Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
- Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
- Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
- Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber’s congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
- Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
- Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
- Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
- Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
- Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
- Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
- Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
- Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
- Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).
- Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
- Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
- He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
- Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the “light-peak substance”. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
- Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).
- Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).
