تخطيط كهربائي مباشر مقرونة (DC-ERG) لتسجيل الاستجابات الكهربائية ذات الضوء المُثار من ظهارة صبغ الشبكية الماوس
Summary
هنا، نقدم طريقة لتسجيل الاستجابات الكهربائية التي تثير الضوء من ظهارة صبغ الشبكية (RPE) في الفئران باستخدام تقنية تعرف باسم DC-ERGs التي وصفها لأول مرة مارمورشتاين، بيتشي، وزملاؤه في أوائل العقد الأول من القرن الحادي والعشرين.
Abstract
ظهارة صبغة الشبكية (RPE) هي أحادية متخصصة من الخلايا التي تقع بشكل استراتيجي بين الشبكية و choriocapillaris التي تحافظ على الصحة العامة والسلامة الهيكلية للمقبرات الضوئية. وRPE هو الاستقطاب، وعرض مستقبلات أو قنوات apically وبسيقل، ويؤدي النقل المتجه من المياه، الأيونات، المستقلبات، ويفرز العديد من السيتوكينات.
في القياسات غير الباضعة الدالة RPE يمكن إجراء باستخدام ERGs مباشرة مقرونة (DC-ERGs). كانت المنهجية وراء DC-ERG رائدة من قبل مارمورشتاين ، بيتشي ، وزملاؤه باستخدام نظام تسجيل التحفيز المصنوع خصيصًا ، وأظهر لاحقًا باستخدام نظام متاح تجاريًا. تستخدم تقنية DC-ERG الشعيرات الدموية الزجاجية المليئة بمحلول الملح المخزن (HBSS) من هانك لقياس الاستجابات الكهربائية الأبطأ لـ RPE التي تم الحصول عليها من تغيرات التركيز التي تثيرها الضوء في الفضاء دون الجانتري بسبب نشاط المستقبلات الضوئية. إن التحفيز الضوئي المطول وطول تسجيل DC-ERG يجعلانها عرضة للانجراف والضوضاء مما يؤدي إلى انخفاض العائد من التسجيلات القابلة للاستخدام. هنا، نقدم طريقة سريعة وموثوق بها لتحسين استقرار التسجيلات مع تقليل الضوضاء باستخدام ضغط الفراغ لتقليل / القضاء على الفقاعات الناتجة عن الـ هبلسزز و حامل القطب. بالإضافة إلى ذلك، يتم تخفيف التحف خط الطاقة باستخدام منظم الجهد / مكيف الطاقة. نحن نشمل بروتوكولات تحفيز الضوء اللازمة لنظام ERG المتاحة تجاريا، فضلا عن النصوص لتحليل مكونات DC-ERG: c-موجة، التذبذب السريع، ذروة الضوء، والاستجابة قبالة. نظراً لسهولة التسجيلات المحسنة وسير العمل السريع للتحليل، فإن هذا البروتوكول المبسط مفيد بشكل خاص في قياس التغيرات المرتبطة بالعمر في وظيفة RPE، وتطور المرض، وفي تقييم التدخل الدوائي.
Introduction
ظهارة صبغة الشبكية (RPE) هي طبقة أحادية من الخلايا المتخصصة التي تصطف في الجزء الخلفي من العين وتمارس وظائف حاسمة للحفاظ على التوازن الشبكية1. RPE يدعم فوتوراسيدات من خلال تجديد الصباغ البصري التقاط الفوتون في عملية تسمى الدورة البصرية2, من خلال المشاركة في البلعومات النهارية من سقيفة الجزء الخارجي نصائح3, وفي نقل المواد الغذائية والمنتجات الأيضية بين مستقبلات فوتونية و choriocapillaris4,5. تشوهات في وظيفة RPE يكمن وراء العديد من أمراض الشبكية البشرية, مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر6,اعورة لوبير الخلقية7,8 وأفضل ضمور البقعي البقعي vitelliform9. كما أنسجة العين المانحة غالبا ما يصعب الحصول عليها فقط لأغراض البحث, نماذج الحيوانات مع التعديلات الجينية يمكن أن توفر طريقة بديلة لدراسة تطور أمراض الشبكية10,11. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ظهور وتطبيق تكنولوجيا CRISPR cas9 يسمح الآن مقدمات الجينوم (الضربة القاضية) أو الحذف (خروج المغلوب) في عملية بسيطة من خطوة واحدة تتجاوز قيود تقنيات استهداف الجينات السابقة12. الطفرة في توافر نماذج جديدة ماوس13 يتطلب بروتوكول تسجيل أكثر كفاءة لوظيفة RPE غير غير الغازية.
ويمكن قياس الاستجابات الكهربائية التي تثير الضوء من RPE يمكن أن يتحقق باستخدام تقنية تخطيط كهربائي مقرونة مباشرة (DC-ERG). عند استخدامها في تركيبة مع تسجيلات ERG التقليدية التي تقيس مستقبلات ضوئية (a-wave) و ثنائي القطب (b-wave) استجابات الخلية14، يمكن لـ DC-ERG تحديد كيفية تغيير خصائص الاستجابة لـ RPE مع انحطاط الشبكية15،16،17 أو ما إذا كان الخلل RPE يسبق فقدان الحساسية الضوئية. يصف هذا البروتوكول طريقة مقتبسة من عمل مارمورشتاين، بيتشي، والزملاء الذين طوروا أولا تقنية DC-ERG16،18،19،20 ويحسن على إعادة إنتاج وسهولة الاستخدام.
يصعب تنفيذ تسجيل DC-ERG بسبب وقت الاكتساب الطويل (9 دقائق) الذي يمكن أن يؤدي أي انقطاع أو إدخال للضوضاء إلى تعقيد تفسير البيانات. وميزة هذه الطريقة الجديدة هي أن خطوط الأساس تصل إلى حالة ثابتة في غضون فترة أقصر من الزمن مما يقلل من احتمال أن يستيقظ الحيوان قبل الأوان من التخدير وأقل عرضة لتشكيل الفقاعة في الأقطاب الشعرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الهامة
يتطلب تسجيل DC-ERG الجيد أقطابًا كهربائية مستقرة خالية من الفقاعات التي تخلق القطع الأثرية والانجراف غير المرغوب فيه لأنها حساسة للغاية للتغيرات في درجة الحرارة والخروج. من الضروري أن يتم تحقيق خط أساس مستقر عندما يتم وضع الأقطاب الكهربائية في محلول ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل صناديق داخل الثقافات. الكتاب نعترف بصدق الدكتور شيلدون ميلر لتوجيهه العلمي ، والمشورة التقنية ، والخبرة في علم وظائف الأعضاء RPE والمرض. يشكر المؤلفان ميغان كوبرا وموظفي رعاية الحيوانات على إدارة مستعمرات الماوس، والدكتور تارون بانسال وريموند تشو ويوان وانغ على الدعم الفني.
Materials
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| Matlab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| needle (ground) electrode | Rhythmlink | 13mm – one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
- Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
- Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
- Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
- Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
- Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber’s congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
- Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
- Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
- Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
- Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
- Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
- Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
- Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
- Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
- Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).
- Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
- Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
- He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
- Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the “light-peak substance”. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
- Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).
- Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).
