Direktgekoppeltes Elektroretinogramm (DC-ERG) zur Aufzeichnung der lichtbeschworenen elektrischen Reaktionen des retinalen Pigmentepithels der Maus
Summary
Hier stellen wir eine Methode zur Aufzeichnung lichtevokierter elektrischer Reaktionen des retinalen Pigmentepithels (RPE) bei Mäusen vor, die eine Technik verwendet, die als DC-ERGs bekannt ist und von Marmorstein, Peachey und Kollegen in den frühen 2000er Jahren beschrieben wurde.
Abstract
Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine spezialisierte Monoschicht von Zellen, die strategisch zwischen der Netzhaut und der Choriokapillare liegen und die allgemeine Gesundheit und strukturelle Integrität der Photorezeptoren erhalten. Das RPE ist polarisiert, zeigt apisch und basal lokalisierte Rezeptoren oder Kanäle, und führt vektoriell Transport von Wasser, Ionen, Metaboliten, und sezernieren mehrere Zytokine.
In vivo nichtinvasive Messungen der RPE-Funktion können mit direkt gekoppelten ERGs (DC-ERGs) durchgeführt werden. Die Methodik hinter dem DC-ERG wurde von Marmorstein, Peachey und Kollegen mit einem kundenspezifischen Stimulationsaufzeichnungssystem entwickelt und später mit einem kommerziell erhältlichen System demonstriert. Die DC-ERG-Technik verwendet Glaskapillaren, die mit Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) gefüllt sind, um die langsameren elektrischen Reaktionen des RPE zu messen, die durch lichtevokte Konzentrationsänderungen im subretinalen Raum aufgrund der Photorezeptoraktivität ausgelöst werden. Der verlängerte Lichtreiz und die Länge der DC-ERG-Aufnahme machen sie anfällig für Drift und Rauschen, was zu einer geringen Ausbeute an verwendbaren Aufnahmen führt. Hier präsentieren wir eine schnelle, zuverlässige Methode zur Verbesserung der Stabilität der Aufnahmen bei gleichzeitiger Reduzierung von Geräuschen durch Verwendung von Vakuumdruck zur Reduzierung/Beseitigung von Blasen, die sich aus der Ausgasung des HBSS- und Elektrodenhalters ergeben. Darüber hinaus werden Stromleitungsartefakte mit einem Spannungsregler/Leistungsaufbereiter abgeschwächt. Wir beinhalten die notwendigen Lichtstimulationsprotokolle für ein handelsübliches ERG-System sowie Skripte zur Analyse der DC-ERG-Komponenten: c-Wave, schnelle Schwingung, Lichtspitzen- und Off-Response. Aufgrund der verbesserten Leichtigkeit der Aufzeichnungen und des schnellen Analyse-Workflows ist dieses vereinfachte Protokoll besonders nützlich bei der Messung altersbedingter Veränderungen der RPE-Funktion, des Krankheitsverlaufs und bei der Bewertung pharmakologischer Interventionen.
Introduction
Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht spezialisierter Zellen, die das hintere Segment des Auges ausbilden und kritische Funktionen ausüben, um die netzhautige Homöostase1aufrechtzuerhalten. Das RPE unterstützt Photorezeptoren durch Regenerierung ihres photonenerfassenden visuellen Pigments in einem Prozess, der als visueller Zyklus2bezeichnet wird, durch Die Teilnahme an der tagesphagozytose der äußeren Segmentspitzen3, und beim Transport von Nährstoffen und Stoffwechselprodukten zwischen Photorezeptoren und der Choriokapillare4,5. Anomalien in der RPE-Funktion unterlegen zahlreiche menschliche Netzhauterkrankungen, wie altersbedingte Makuladegeneration6, Lebers angeborene Amaurose7,8 und Best vitelliform Makuladystrophie9. Da Spenderaugengewebe oft nur für Forschungszwecke schwer zu erhalten sind, können Tiermodelle mit genetischen Veränderungen eine alternative Möglichkeit bieten, die Entwicklung von Netzhauterkrankungen zu untersuchen10,11. Darüber hinaus ermöglicht die Entstehung und Anwendung der CRISPR cas9-Technologie nun genomische Einschleppungen (Knock-in) oder Deletionen (Knock-out) in einem einfachen, einstufigen Prozess, der die Grenzen früherer Gen-Targeting-Technologien überschreitet12. Der Boom der Verfügbarkeit neuer Mausmodelle13 erfordert ein effizienteres Aufzeichnungsprotokoll, um die RPE-Funktion nicht-invasiv auszuwerten.
Die Messung der lichtevozierten elektrischen Ansprechungen des RPE kann mit einer direkt gekoppelten Elektroretinogramm-Technik (DC-ERG) erreicht werden. In Kombination mit herkömmlichen ERG-Aufnahmen, die die Photorezeptor- (a-Welle) und bipolaren (b-Wellen) Zellreaktionen14messen, kann das DC-ERG definieren, wie sich die Ansprecheigenschaften des RPE mit Netzhautdegeneration15,16,17 ändern oder ob die RPE-Dysfunktion dem Verlust des Photorezeptors vorausgeht. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die an die Arbeit von Marmorstein, Peachey und Kollegen angepasst wurde, die zuerst die DC-ERG-Technik16,18,19,20 entwickelt haben und die Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit verbessern.
Die DC-ERG-Aufnahme ist aufgrund der langen Erfassungszeit (9 min), in der eine Unterbrechung oder Einschleppung von Rauschen die Interpretation der Daten erschweren kann, schwierig durchzuführen. Der Vorteil dieser neuen Methode ist, dass die Basislinien innerhalb einer kürzeren Zeitzeit einen stabilen Zustand erreichen und die Wahrscheinlichkeit verringern, dass das Tier vorzeitig aus der Anästhesie erwacht und weniger anfällig für Blasenbildung in den Kapillarelektroden ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte
Eine gute DC-ERG-Aufnahme erfordert stabile Elektroden, die frei von Blasen sind, die Artefakte und unerwünschte Drift erzeugen, da sie extrem empfindlich auf Ausgasung und Temperaturänderungen reagieren. Es ist wichtig, dass eine stabile Ausgangsbasis erreicht wird, wenn die Elektroden in der HBSS-Badelösung platziert werden, bevor sie mit der Mausaufzeichnung fortfahren. Kleine Blasen neigen dazu, sich an der Basis der Kapillarelektrode oder um die Sili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von nei-Intramural-Fonds unterstützt. Die Autoren würdigen Dr. Sheldon Miller aufrichtig für seine wissenschaftliche Beratung, technische Beratung und Expertise in RPE-Physiologie und Krankheit. Die Autoren danken Megan Kopera und dem Tierpfleger für die Verwaltung der Mauskolonien und Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou und Yuan Wang für die technische Unterstützung.
Materials
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| Matlab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| needle (ground) electrode | Rhythmlink | 13mm – one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
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