Elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG) per la registrazione delle risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico del mouse
Summary
Qui, presentiamo un metodo per registrare le risposte elettriche evocate dalla luce dell’epitelio pigmentato retinico (RPE) nei topi usando una tecnica nota come DC-ENG descritta per la prima volta da Marmorstein, Peachey e colleghi nei primi anni 2000.
Abstract
L’epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato specializzato di cellule strategicamente situate tra la retina e il coriocapillaris che mantengono la salute generale e l’integrità strutturale dei fotorecettori. L’RPE è polarizzato, esibendo recettori o canali localizzati in modo apico e basale, ed esegue il trasporto vettoriale di acqua, ioni, metaboliti e secenere diverse citochine.
Le misurazioni nonive in vivo della funzione RPE possono essere effettuate utilizzando ENG ad accoppiamento diretto (DC-ENG). La metodologia alla base del DC-ERG è stata introdotta da Marmorstein, Peachey e colleghi che utilizzano un sistema di registrazione della stimolazione personalizzato e in seguito ha dimostrato di utilizzare un sistema disponibile in commercio. La tecnica DC-ERG utilizza capillari di vetro riempiti con la soluzione di sale tamponato (HBSS) di Hank per misurare le risposte elettriche più lente dell’RPE suscitate dai cambiamenti di concentrazione evocati dalla luce nello spazio subretinale a causa dell’attività del fotorecettore. Lo stimolo luminoso prolungato e la lunghezza della registrazione DC-ERG lo rendono vulnerabile alla deriva e al rumore con conseguente bassa resa di registrazioni utilizzabili. Qui presentiamo un metodo rapido e affidabile per migliorare la stabilità delle registrazioni riducendo al contempo il rumore utilizzando la pressione del vuoto per ridurre / eliminare le bolle derivanti dal degassamento dell’HBSS e del supporto per elettrodi. Inoltre, gli artefatti della linea elettrica vengono attenuati utilizzando un regolatore di tensione / condizionatore di potenza. Includiamo i protocolli di stimolazione della luce necessari per un sistema ERG disponibile in commercio e script per l’analisi dei componenti DC-ERG: onda c, oscillazione rapida, picco di luce e risposta off. Grazie alla migliore facilità di registrazione e al flusso di lavoro di analisi rapida, questo protocollo semplificato è particolarmente utile per misurare i cambiamenti legati all’età nella funzione RPE, nella progressione della malattia e nella valutazione dell’intervento farmacologico.
Introduction
L’epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato di cellule specializzate che allineano il segmento posteriore dell’occhio ed esercitano funzioni critiche per mantenere l’omeostasi retinica1. L’RPE supporta i fotorecettori rigenerando il loro pigmento visivo che cattura fotoni in un processo chiamato ciclovisivo 2,partecipando alla fagocitosi diurna delle punte del segmentoesterno capannone 3,e nel trasporto di nutrienti e prodotti metabolici tra fotorecettori e coriocapillaris4,5. Le anomalie nella funzione RPE sono alla base di numerose malattie della retina umana, come la degenerazione maculare legata all’età6,l’amaurosi congenita di Leber7,8 e la migliore distrofia maculare vitelliforme9. Poiché i tessuti oculari del donatore sono spesso difficili da ottenere esclusivamente a scopo di ricerca, i modelli animali con modifiche genetiche possono fornire un modo alternativo per studiare lo sviluppo di malattie retiniche10,11. Inoltre, l’emergere e l’applicazione della tecnologia CRISPR cas9 consente ora l’introduzione genomica (knock-in) o le eliminazioni (knock-out) in un processo semplice in una sola fase che supera i limiti delle precedenti tecnologie di targeting genico12. Il boom nella disponibilità di nuovi modelli di mouse13 richiede un protocollo di registrazione più efficiente per valutare in modo non invasivo la funzione RPE.
La misurazione delle risposte elettriche evocate dalla luce dell’RPE può essere ottenuta utilizzando una tecnica di elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG). Se utilizzato in combinazione con registrazioni ERG convenzionali che misurano le risposte cellulari fotorecettore (a-onda) e bipolare (onda b)14, il DC-ERG può definire come cambiano le proprietà di risposta dell’RPE con la degenerazione retinica15,16,17 o se la disfunzione RPE precede la perdita del fotorecettore. Questo protocollo descrive un metodo adattato dal lavoro di Marmorstein, Peachey e colleghi che per primi hanno sviluppato la tecnica DC-ERG16,18,19,20 e migliora la riproducibilità e la facilità d’uso.
La registrazione DC-ERG è difficile da eseguire a causa del lungo tempo di acquisizione (9 min) durante il quale qualsiasi interruzione o introduzione del rumore può complicare l’interpretazione dei dati. Il vantaggio di questo nuovo metodo è che le linee di base raggiungono lo stato stazionario in un lasso di tempo più breve riducendo la probabilità che l’animale si svegli prematuramente dall’anestesia ed è meno incline alla formazione di bolle negli elettrodi capillari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi critici
Una buona registrazione DC-ERG richiede elettrodi stabili che sono liberi da bolle che creano artefatti e deriva indesiderata in quanto sono estremamente sensibili al degassamento e alle variazioni di temperatura. È essenziale che si ottiene una linea di base stabile quando gli elettrodi vengono posizionati nella soluzione da bagno HBSS prima di procedere con la registrazione del mouse. Piccole bolle tendono a raccogliere alla base dell’elettrodo capillare o …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi intramurali NEI. Gli autori riconoscono sinceramente il Dr. Sheldon Miller per la sua guida scientifica, consulenza tecnica e competenza nella fisiologia e nelle malattie RPE. Gli autori ringraziano Megan Kopera e lo staff di cura degli animali per la gestione delle colonie di topi, e il Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou e Yuan Wang per il supporto tecnico.
Materials
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| Matlab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| needle (ground) electrode | Rhythmlink | 13mm – one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
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