Das Protokoll beschreibt experimentelle Methoden zur Erlangung stabiler Haupthistokompatibilitätskomplexe (MHC) Klasse I durch potenzielle β 2-Mikroglobulin(β2m) Substitutionen verschiedener Arten. Untersucht wurde der strukturelle Vergleich von MHC I, der durch homologe und heterologe β2m stabilisiert wurde.
Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) spielt eine zentrale Rolle bei der Darstellung von Antigenpeptid und T-Zell-Immunreaktionen gegen Infektionskrankheiten und Tumorentwicklung. Die hybride MHC I, komplexiert mit heterologen β 2-Mikroglobulin (β2m) Substitution verschiedener Arten kann in vitro stabilisiert werden. Dies ist ein praktikables Mittel, um MHC I von Säugetieren zu untersuchen, wenn die homologe β2m nicht verfügbar ist. In der Zwischenzeit wird darauf hingewiesen, dass Die β2m Substitution die Peptiddarstellung nicht signifikant beeinflusst. Allerdings gibt es eine begrenzte Zusammenfassung hinsichtlich der Methodik und der Technologie für den Hybrid MHC I, der mit heterologen β2-Mikroglobulin (β2m) komplexiert ist. Hierin werden Methoden zur Bewertung der Durchführbarkeit heterologer β2m Substitution in der MHC-I-Studie vorgestellt. Diese Methoden umfassen die Vorbereitung von Ausdruckskonstrukten. Reinigung von Inklusionskörpern und Umfaltung des MHC-Komplexes; Bestimmung der Protein-Thermostabilität; Kristallsiebung und Strukturbestimmung. Diese Studie bietet eine Empfehlung zum Verständnis der Funktion und Struktur von MHC I und ist auch wichtig für die Bewertung der T-Zell-Reaktion während der Infektionskrankheit und Tumorimmuntherapie.
Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) existiert in allen Wirbeltieren und ist eine Reihe von Genen, die die zellvermittelte Immunität gegen infektiöse Krankheitserreger bestimmen. MHC-Klasse I präsentiert endogene Peptide, wie virale Komponenten, die bei virus-Infektion produziert werden, T-Zellrezeptoren (TCR) auf der Oberfläche von CD8+ T-Zellen, um die zelluläre Immunität zu vermitteln und an der Immunregulation1teilzunehmen. Eine strukturelle Studie der Ankehrung von MHC I an Peptide liefert Informationen über Peptidbindungsmotive und Präsentationsmerkmale von MHC-I-Molekülen, die bei der Bewertung von CD8+ T-Zell-Immunantworten und der Impfstoffentwicklung eine entscheidende Rolle spielen.
Seit der ersten Kristallisation und strukturellen Bestimmung von MHC I molecular durch Bjorkman et al.2hat die Kristallstrukturanalyse von MHC I Molekülen das Verständnis der Bindung von Peptiden an MHC I Moleküle stark gefördert und hilft, die Wechselwirkung von Lichtketten mit schweren Ketten und Peptiden zu verstehen. Eine Reihe von Folgestudien zeigte, dass, obwohl die Gene, die die Lichtkette kodieren, nicht mit dem MHC verbunden sind, die Lichtkette ein Schlüsselprotein für die Montage von MHC I Molekülen3,4ist. Es interagiert mit den drei Domänen der MHC-Klasse I Moleküle auf mehreren Oberflächen. Wenn die Lichtkette fehlt, können MHC-Moleküle der Klasse I nicht korrekt auf der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen exprimiert werden und können nicht mit TCR interagieren, um ihre immunologischen Funktionen auszuüben.
MHC I besteht aus einer schweren Kette (H-Kette) und einer Leichten Kette (d.h. β 2-Mikroglobulin (β2m)) und wird durch Bindung an ein geeignetes Peptid5montiert. Das extrazelluläre Segment der H-Kette besteht aus den Domänen6, 1, 2 und 3 . Die Domänen 1 und 2 bilden die Peptidbindungsnut (PBG). Die β2m Kette fungiert als strukturelle Untereinheit des Montagekomplexes in MHC I, stabilisiert die Konformation des Komplexes und ist ein molekulares Chaperon für MHC I H Kettenfaltung7,8,9. Eine Reihe von Studien haben gezeigt, dass MHC I H Ketten von verschiedenen Säugetieren wie Fledermaus (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10, rhesus makaken (Primaten) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, Maus (Rodentia) (H-2Kd)14,15, Hund (Carnivora) (DLA-88*50801)16, Rinder (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 und Pferde (Perissodactyla) (Eqca-N*00602 und Eqca-N*00601)18 können mit heterologen β2m (Tabelle 1) kombinieren. Diese Hybridmoleküle werden häufig in strukturellen und funktionellen Studien verwendet. Die Methodik für die funktionelle und strukturelle Untersuchung des hybriden MHC I mit heterologen β2m ist jedoch noch nicht zusammengefasst. Unterdessen bleibt die strukturelle Grundlage für die ausgetauschte β2m zwischen verschiedenen Taxa unklar.
Hierin werden das Verfahren für MHC I Expression, Umfaltung, Kristallisation, Kristalldatenerfassung und Strukturbestimmung zusammengefasst. Darüber hinaus werden mögliche Substitutionen von β2m von verschiedenen Arten durch vergleicht die strukturelle Konformation von MHC I durch homologe und heterologe β2m stabilisiert. Diese Methoden werden für weitere MHC I Strukturstudie und CD8+ T-Zell-Immunantwort-Bewertung bei Krebs und Infektionskrankheiten hilfreich sein.
Der Aufbau eines Hybridproteinkomplexes durch heterologe Substitution aus verschiedenen Taxa ist eine gemeinsame Strategie für funktionelle und strukturelle Untersuchungen, wenn der homologe Komplex nicht verfügbar ist, wie z. B. im MHC I und seinen Liganden. Allerdings gibt es eine begrenzte Zusammenfassung in Bezug auf die Methodik und die Technologie. Dabei wurde die Struktur der Fledermaus MHC I, Ptal-N*01:01, stabilisiert durch b2m oder h2m, analysiert. Die wichtigsten Aminosäuren von β<sub…
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde durch den offenen Fonds des staatlichen Schlüssellabors für pharmazeutische Biotechnologie, Nan-jing University, China (Grant-Nr. KF-GN-201905), die National Natural Science Foundation of China (Stipendien 81971501). William J. Liu wird vom Excellent Young Scientist Program der NSFC (81822040) und Beijing New-Star Plan of Science and Technology (Z181100006218080) unterstützt.
10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
APS | Sigma | A3678-100G | |
BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
GSH | Amresco | 0399-250G | |
GSSG | Amresco | 0524-100G | |
Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
NaCl | Solarbio | S8210 | |
Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 |