Summary

Stabilität und Struktur der Fledermaus Haupt Histokompatibilität Komplex Klasse I mit heterologen β2-Mikroglobulin

Published: March 10, 2021
doi:

Summary

Das Protokoll beschreibt experimentelle Methoden zur Erlangung stabiler Haupthistokompatibilitätskomplexe (MHC) Klasse I durch potenzielle β 2-Mikroglobulin(β2m) Substitutionen verschiedener Arten. Untersucht wurde der strukturelle Vergleich von MHC I, der durch homologe und heterologe β2m stabilisiert wurde.

Abstract

Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) spielt eine zentrale Rolle bei der Darstellung von Antigenpeptid und T-Zell-Immunreaktionen gegen Infektionskrankheiten und Tumorentwicklung. Die hybride MHC I, komplexiert mit heterologen β 2-Mikroglobulin (β2m) Substitution verschiedener Arten kann in vitro stabilisiert werden. Dies ist ein praktikables Mittel, um MHC I von Säugetieren zu untersuchen, wenn die homologe β2m nicht verfügbar ist. In der Zwischenzeit wird darauf hingewiesen, dass Die β2m Substitution die Peptiddarstellung nicht signifikant beeinflusst. Allerdings gibt es eine begrenzte Zusammenfassung hinsichtlich der Methodik und der Technologie für den Hybrid MHC I, der mit heterologen β2-Mikroglobulin (β2m) komplexiert ist. Hierin werden Methoden zur Bewertung der Durchführbarkeit heterologer β2m Substitution in der MHC-I-Studie vorgestellt. Diese Methoden umfassen die Vorbereitung von Ausdruckskonstrukten. Reinigung von Inklusionskörpern und Umfaltung des MHC-Komplexes; Bestimmung der Protein-Thermostabilität; Kristallsiebung und Strukturbestimmung. Diese Studie bietet eine Empfehlung zum Verständnis der Funktion und Struktur von MHC I und ist auch wichtig für die Bewertung der T-Zell-Reaktion während der Infektionskrankheit und Tumorimmuntherapie.

Introduction

Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) existiert in allen Wirbeltieren und ist eine Reihe von Genen, die die zellvermittelte Immunität gegen infektiöse Krankheitserreger bestimmen. MHC-Klasse I präsentiert endogene Peptide, wie virale Komponenten, die bei virus-Infektion produziert werden, T-Zellrezeptoren (TCR) auf der Oberfläche von CD8+ T-Zellen, um die zelluläre Immunität zu vermitteln und an der Immunregulation1teilzunehmen. Eine strukturelle Studie der Ankehrung von MHC I an Peptide liefert Informationen über Peptidbindungsmotive und Präsentationsmerkmale von MHC-I-Molekülen, die bei der Bewertung von CD8+ T-Zell-Immunantworten und der Impfstoffentwicklung eine entscheidende Rolle spielen.

Seit der ersten Kristallisation und strukturellen Bestimmung von MHC I molecular durch Bjorkman et al.2hat die Kristallstrukturanalyse von MHC I Molekülen das Verständnis der Bindung von Peptiden an MHC I Moleküle stark gefördert und hilft, die Wechselwirkung von Lichtketten mit schweren Ketten und Peptiden zu verstehen. Eine Reihe von Folgestudien zeigte, dass, obwohl die Gene, die die Lichtkette kodieren, nicht mit dem MHC verbunden sind, die Lichtkette ein Schlüsselprotein für die Montage von MHC I Molekülen3,4ist. Es interagiert mit den drei Domänen der MHC-Klasse I Moleküle auf mehreren Oberflächen. Wenn die Lichtkette fehlt, können MHC-Moleküle der Klasse I nicht korrekt auf der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen exprimiert werden und können nicht mit TCR interagieren, um ihre immunologischen Funktionen auszuüben.

MHC I besteht aus einer schweren Kette (H-Kette) und einer Leichten Kette (d.h. β 2-Mikroglobulin (β2m)) und wird durch Bindung an ein geeignetes Peptid5montiert. Das extrazelluläre Segment der H-Kette besteht aus den Domänen6, 1, 2 und 3 . Die Domänen 1 und 2 bilden die Peptidbindungsnut (PBG). Die β2m Kette fungiert als strukturelle Untereinheit des Montagekomplexes in MHC I, stabilisiert die Konformation des Komplexes und ist ein molekulares Chaperon für MHC I H Kettenfaltung7,8,9. Eine Reihe von Studien haben gezeigt, dass MHC I H Ketten von verschiedenen Säugetieren wie Fledermaus (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10, rhesus makaken (Primaten) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, Maus (Rodentia) (H-2Kd)14,15, Hund (Carnivora) (DLA-88*50801)16, Rinder (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 und Pferde (Perissodactyla) (Eqca-N*00602 und Eqca-N*00601)18 können mit heterologen β2m (Tabelle 1) kombinieren. Diese Hybridmoleküle werden häufig in strukturellen und funktionellen Studien verwendet. Die Methodik für die funktionelle und strukturelle Untersuchung des hybriden MHC I mit heterologen β2m ist jedoch noch nicht zusammengefasst. Unterdessen bleibt die strukturelle Grundlage für die ausgetauschte β2m zwischen verschiedenen Taxa unklar.

Hierin werden das Verfahren für MHC I Expression, Umfaltung, Kristallisation, Kristalldatenerfassung und Strukturbestimmung zusammengefasst. Darüber hinaus werden mögliche Substitutionen von β2m von verschiedenen Arten durch vergleicht die strukturelle Konformation von MHC I durch homologe und heterologe β2m stabilisiert. Diese Methoden werden für weitere MHC I Strukturstudie und CD8+ T-Zell-Immunantwort-Bewertung bei Krebs und Infektionskrankheiten hilfreich sein.

Protocol

1. Vorbereitung von Ausdruckskonstrukten Rufen Sie die Sequenzen von MHC-Genen der Klasse I (einschließlich vorhergesagter Gene) von Fledermäusen aus der NCBI-Datenbank ab. Holen Sie höhere MHC I schwere Kettensequenzen aus der Immuno Polymorphism Database (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) und der UniProt-Datenbank (www.uniprot.org) ab. Um lösliche MHC-Komplexe zu erhalten, mutagenisieren Sie die Sequenzen, um die zytosolischen und transmembranen Regionen zu entfernen. Klonen Sie d…

Representative Results

Frühere Arbeiten berichteten, dass das HeV-abgeleitete HeV1 (DFANTFLP) Peptid von Ptal-N* 01:0110,19vorgestellt wurde. Dabei wurde die Bindungskapazität dieses Peptids an Ptal-N*01:01 mit homologe Fledermaus β2m (b 2<font face…

Discussion

Der Aufbau eines Hybridproteinkomplexes durch heterologe Substitution aus verschiedenen Taxa ist eine gemeinsame Strategie für funktionelle und strukturelle Untersuchungen, wenn der homologe Komplex nicht verfügbar ist, wie z. B. im MHC I und seinen Liganden. Allerdings gibt es eine begrenzte Zusammenfassung in Bezug auf die Methodik und die Technologie. Dabei wurde die Struktur der Fledermaus MHC I, Ptal-N*01:01, stabilisiert durch b2m oder h2m, analysiert. Die wichtigsten Aminosäuren von β<sub…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde durch den offenen Fonds des staatlichen Schlüssellabors für pharmazeutische Biotechnologie, Nan-jing University, China (Grant-Nr. KF-GN-201905), die National Natural Science Foundation of China (Stipendien 81971501). William J. Liu wird vom Excellent Young Scientist Program der NSFC (81822040) und Beijing New-Star Plan of Science and Technology (Z181100006218080) unterstützt.

Materials

10 kDa MMCO membrane Merck millipore PLGC07610
30% Acrylamide LABLEAD A3291-500ml*5
5×Protein SDS Loading Novoprotein PM099-01A
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff Merck millipore UFC901096
Ampicillin Inalco 1758-9314
APS Sigma A3678-100G
BL21(DE3) strain TIANGEN CB105-02
DMSO MP 219605580 Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
DTT Solarbio D1070 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
EDTA-2Na KeyGEN BioTECH KGT515500
Glycerin HUSHI 10010618
GSH Amresco 0399-250G
GSSG Amresco 0524-100G
Guanidine hydrochloride Amresco E424-5KG
hβ2m our lab Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).
IPTG Inalco 1758-1400
L-Arginine Hydrochloride Amresco 0877-5KG
NaCl Solarbio S8210
Protein Marker Fermentas 26614
SDS Boao Rui Jing A112130
Superdex Increase 200 10/300 GL GE Healthcare 28990944
TEMED Thermo 17919 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.
Tris-HCl Amresco 0497-5KG
Triton X-100 Bioruler RH30056-100mL
Tryptone Oxoid LP0042
Yeast extract Oxoid LP0021

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Zhang, D., Liu, K., Lu, D., Wang, P., Zhang, Q., Liu, P., Zhao, Y., Chai, Y., Lyu, J., Qi, J., Liu, W. J. Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous β2-Microglobulin. J. Vis. Exp. (169), e61462, doi:10.3791/61462 (2021).

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