Estabilidade e Estrutura do Complexo de Histocompatibilidade Maior do Morcego Classe I com β Heterologous2-Microglobulina
Summary
O protocolo descreve métodos experimentais para obter substituições estáveis do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classe I através de substituições potenciais β 2-microglobulina (β2m) de diferentes espécies. A comparação estrutural do MHC I estabilizada por homólogos e heteromaníacos β2m foram investigadas.
Abstract
O maior complexo de histocompatibilidade (MHC) desempenha um papel fundamental na apresentação de peptídeos de antígeno e respostas imunes de células T contra doenças infecciosas e desenvolvimento de tumores. O MHC híbrido I complexo com β substituição heterologous β 2-microglobulina (β2m) de diferentes espécies pode ser estabilizado in vitro. Este é um meio viável para estudar MHC I de mamíferos, quando o homólogo β2m não está disponível. Enquanto isso, é indicado que a substituição de mamíferos β2m não afeta significativamente a apresentação de peptídeos. No entanto, há uma resumida limitada em relação à metodologia e à tecnologia para o MHC híbrido I complexizado com heterologos β 2-microglobulina (β2m). Nesse meio, são apresentados métodos para avaliar a viabilidade da β substituição de2m no estudo MHC I. Esses métodos incluem a preparação de construtos de expressão; purificação de corpos de inclusão e redobramento do complexo mhc; determinação da termoestabilidade proteica; triagem de cristal e determinação da estrutura. Este estudo fornece uma recomendação para a compreensão da função e estrutura do MHC I, e também é significativo para avaliação de resposta celular T durante doenças infecciosas e imunoterapia tumoral.
Introduction
O maior complexo de histocompatibilidade (MHC) existe em todos os vertebrados e é um conjunto de genes que determina a imunidade mediada por células a patógenos infecciosos. A classe I do MHC apresenta peptídeos endógenos, como componentes virais produzidos após a infecção por vírus, aos receptores de células T (TCR) na superfície das células CD8+ T para mediar a imunidade celular e participar da regulação imunológica1. Um estudo estrutural de MHC I vinculando-se aos peptídeos fornece informações sobre motivos de ligação de peptídeos e características de apresentação por moléculas de MHC I, que desempenha papéis vitais na avaliação das respostas imunes de células CD8+ T e desenvolvimento de vacinas.
Desde a primeira cristalização e determinação estrutural do MHC I molecular por Bjorkman et al.2, a análise da estrutura cristalina das moléculas de MHC I promoveu muito a compreensão de como os peptídeos se ligam às moléculas de MHC I, e ajuda a entender a interação das cadeias leves com correntes pesadas e peptídeos. Uma série de estudos de acompanhamento indicaram que, embora os genes que codificam a cadeia de luz não esteja associados ao MHC, a cadeia de luz é uma proteína chave para o montagem de moléculas de MHC I3,4. Ele interage com os três domínios das moléculas da classe I do MHC em múltiplas superfícies. Quando a cadeia de luz está ausente, as moléculas classe I do MHC não podem ser corretamente expressas na superfície das células que apresentam antígenos e não podem interagir com o TCR para exercer suas funções imunológicas.
MHC I é composto por uma corrente pesada (cadeia H) e cadeia leve (ou seja, β 2-microglobulina (β2m)), e é montado através de ligação a um peptídeo adequado5. O segmento extracelular da cadeia H consiste nos domínios α1, α2 e α36. Os domínios α1 e α2 formam o sulco de ligação de peptídeo (PBG). A cadeia βde 2m atua como subunidade estrutural do complexo conjunto em MHC I, estabilizando a conformação do complexo, e é uma acompanhante molecular para a cadeia MHC I H dobrando7,8,9. Uma série de estudos mostraram que cadeias MHC I H de vários mamíferos, como morcego (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10, rhesus macaque (Primatas) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, mouse (Rodentia) (H-2Kd)14,15, cão (Carnivora) (DLA-88 * 50801)16, gado (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 e equino (Periss eodactyla) (Eqca-N*00602 e Eqca-N*00601)18 podem combinar com heterologos β2m(Tabela 1). Essas moléculas híbridas são frequentemente usadas em estudos estruturais e funcionais. No entanto, ainda não está resumida a metodologia para o estudo funcional e estrutural do HÍBRIDO MHC I com β heterologos de2m. Enquanto isso, a base estrutural para o intercambio β2m entre diferentes taxas permanece incerta.
Aqui, o procedimento para expressão de MHC I, redobramento, cristalização, coleta de dados de cristal e determinação da estrutura são resumidos. Além disso, são analisadas substituições potenciais de β2m de diferentes espécies através da comparação da conformação estrutural do MHC I estabilizada por β homônomo e heteróloga de2m. Esses métodos serão úteis para mais estudo estrutural MHC I e avaliação de resposta imune de células CD8+ T em câncer e doenças infecciosas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A construção de um complexo proteico híbrido por meio de substituição heteróloga de diferentes taxas é uma estratégia comum para investigações funcionais e estruturais quando o complexo homólogo não está disponível, como no MHC I e seus ligantes. No entanto, há uma resumida limitada em relação à metodologia e à tecnologia. Aqui, foi analisada a estrutura do morcego MHC I, Ptal-N*01:01, estabilizada por bβ2m ou hβ2m. Os principais aminoácidos de β ligação de2m ao P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo fundo aberto do laboratório de biotecnologia farmacêutica da Universidade de Nan-jing, China (Grant no. KF-GN-201905), a Fundação Nacional de Ciência Natural da China (concede 81971501). William J. Liu é apoiado pelo Excelente Programa de Jovens Cientistas do NSFC (81822040) e pelo Plano de Ciência e Tecnologia de Pequim (Z181100006218080).
Materials
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
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