استقرار وهيكل من الخفافيش الهيستوكومباينية الرئيسية مجمع الفئة الأولى مع heterologous β2-Microglobulin
Summary
يصف البروتوكول الطرق التجريبية للحصول على مستقر مجمع الهيستوتكية الرئيسية (MHC) الفئة الأولى من خلال β المحتملة2-ميكروغلوبولين (β2م) استبدالات من أنواع مختلفة. دراسة المقارنة الهيكلية من MHC I استقرت بواسطة homologous و heterologousβ 2م تم التحقيق.
Abstract
يلعب مجمع التحلل الرئيسي (MHC) دورًا محوريًا في عرض ببتيد المستضد والاستجابات المناعية للخلايا التائية ضد الأمراض المعدية وتطور الورم. الهجين MHC I معقدة مع β2-ميكروغلوبولين (β2م) يمكن أن تستقر في المختبر. هذا هو وسيلة مجدية لدراسة MHC I من الثدييات، عندما β homologous2متر غير متوفر. وفي الوقت نفسه، يشار إلى أن الثدييات βاستبدال 2م لا يؤثر بشكل كبير على عرض الببتيد. ومع ذلك، هناك ملخص محدود فيما يتعلق بالمنهجية والتكنولوجيا ل MHC الهجين I معقدة مع β2-microglobulin (β2م). هنا، يتم عرض طرق لتقييم جدوى استبدال β2م في دراسة MHC الأول. وتشمل هذه الأساليب إعداد بنيات التعبير؛ (أ) تنقية هيئات الإدماج وإعادة تجمّع مجمع MHC؛ تحديد حرارة البروتين. الكريستال الفحص وتحديد الهيكل. تقدم هذه الدراسة توصية لفهم وظيفة وهيكل MHC I ، وهي مهمة أيضًا لتقييم استجابة الخلايا التائية أثناء الأمراض المعدية والعلاج المناعي للورم.
Introduction
يوجد مجمع التحلل (MHC) الرئيسي في جميع الفقاريات وهو مجموعة من الجينات التي تحدد المناعة التي تتوسطها الخلايا لمسببات الأمراض المعدية. MHC الفئة الأول يعرض الببتيدات الذاتية، مثل المكونات الفيروسية المنتجة على عدوى الفيروس، لمستقبلات الخلايا T (TCR) على سطح CD8+ الخلايا T للتوسط مناعة الخلوية والمشاركة في تنظيم المناعة1. توفر دراسة هيكلية من MHC I ملزمة الببتيدات معلومات حول الزخارف ملزمة الببتيد وميزات العرض من قبل جزيئات MHC الأول، الذي يلعب أدوارا حيوية في تقييم الاستجابات المناعية CD8+ T الخلية وتطوير اللقاحات.
منذ التبلور الأول والتصميم الهيكلي للجزيئية MHC I بواسطة Bjorkman et al.2، عزز تحليل البنية البلورية لجزيئات MHC I بشكل كبير فهم كيفية ربط الببتيدات بجزيئات MHC I ، ويساعد على فهم تفاعل السلاسل الخفيفة مع السلاسل الثقيلة والببتيدات. وأشارت سلسلة من الدراسات المتابعة أنه على الرغم من أن الجينات ترميز سلسلة الضوء لا يرتبط مع MHC، سلسلة الضوء هو بروتين رئيسي لتجميع جزيئات MHC الأول3،4. يتفاعل مع المجالات الثلاثة من جزيئات الفئة MHC I على أسطح متعددة. عندما تكون سلسلة الضوء غائبة، لا يمكن التعبير عن جزيئات MHC من الفئة I بشكل صحيح على سطح الخلايا التي تقدم المستضد ولا يمكن أن تتفاعل مع TCR لممارسة وظائفها المناعية.
MHC الأول يتكون من سلسلة ثقيلة (سلسلة H) وسلسلة خفيفة (أي β2-ميكروغلوبولين (β2م))، ويتم تجميعها من خلال ربط لببتيد مناسب5. يتكون الجزء خارج الخلية من سلسلة H من مجالات α1 وα2 وα36. تشكل مجالات α1 وα2 الأخدود ملزم الببتيد (PBG). سلسلة β2متر بمثابة وحدة فرعية هيكلية من مجمع التجميع في MHC I، استقرار التشكل من المجمع، وهو مرافق الجزيئية ل MHC I H سلسلة قابلة للطي7،8،9. وقد أظهرت سلسلة من الدراسات أن سلاسل MHC I H من الثدييات المختلفة مثل الخفافيش (Chiroptera) (Ptal-N * 01:01)10، ريسوس المكاك (الرئيسيات) (مامو – ب * 17)11 (مامو – A * 01)12 (مامو – A * 02)13، فأر (القوارض) (H – 2Kد)14،1 15, (Carnivora) (DLA-88*50801)16, ماشية (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 وequine (بيريس 25- يمكن الجمع بين18 و 18 مع β2م(الجدول 1)(Eqca-N*00602) (Eqca-N*00601). وغالبا ما تستخدم هذه الجزيئات الهجينة في الدراسات الهيكلية والوظيفية. ومع ذلك، لم يتم تلخيص منهجية الدراسة الوظيفية والهيكلية للمهجن الهجين MHC I مع β2م. وفي الوقت نفسه، لا يزال الأساس الهيكلي للتبادل β2متر بين مختلف أنواع الـ 2 من نوع “تاكسا” غير واضح.
هنا ، ويرد ملخصا للإجراءات للتعبير MHC الأول ، والمجلدات ، والتبلور ، وجمع البيانات الكريستال وتحديد الهيكل. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تحليل بدائل محتملة β2متر من الأنواع المختلفة من خلال مقارنة التشكل الهيكلي لل MHC I استقرت من قبل β2م المتجانية المتجانسة. هذه الأساليب سوف تكون مفيدة لمزيد من MHC I الدراسة الهيكلية وC8+ T تقييم الاستجابة المناعية خلية في السرطان والأمراض المعدية.
Protocol
Representative Results
Discussion
بناء مجمع البروتين الهجين من خلال استبدال heterologous من مختلف التاشيا هي استراتيجية مشتركة للتحقيقات الوظيفية والهيكلية عندما لا تتوفر مجمع متماثل، كما هو الحال في MHC الأول ويغاندس. غير أن الملخصات المتعلقة بالمنهجية والتكنولوجيا محدودة. هنا، تم تحليل هيكل الخفافيش MHC الأول، Ptal-N * 01:01، استقرت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذه الدراسة من قبل الصندوق المفتوح من مختبر الدولة الرئيسية للتكنولوجيا الحيوية الصيدلانية، جامعة نان جينغ، الصين (منحة لا. KF-GN-201905)، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنح 81971501). وليام J. ليو هو مدعوم من قبل برنامج العلماء الشباب ممتازة من NSFC (81822040) وبكين خطة نجمة جديدة للعلوم والتكنولوجيا (Z181100006218080).
Materials
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
- Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
- Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
- Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
- Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
- Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
- Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
- Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
- Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
- Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).
- Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
- Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
- Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
- Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
- Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
- Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
- Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
- Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
- Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
- Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
- Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
- Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
- Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
- Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).
- McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
- Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250 (2019).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).
