Heterologöz β2-Microglobulin ile Yarasa Major Histocompatibility Complex Class I'in Stabilitesi ve Yapısı
Summary
Protokol, farklı türlerden potansiyel β 2 mikroglobulin (β 2m)ikameyoluyla stabil majör histocompatibility complex (MHC) sınıfı I elde etmek için deneysel yöntemleri açıklar. MHC I’in homolog ve heterolog β2m ile stabilize edilen yapısal karşılaştırması araştırılmıştır.
Abstract
Başlıca histocompatibility complex (MHC), bulaşıcı hastalık ve tümör gelişimine karşı antijen peptit sunumunda ve T hücre immün yanıtlarında önemli bir rol oynar. Farklı türlerden heterolog β2mikroglobulin (β 2 m)ikameile karmaşık olan hibrit MHC in vitro stabilize edilebilir. Bu, 2 m’lik homolog β mevcut olmadığında, memelilerin MHCI’iniincelemek için mümkün bir araçtır. Bu arada,2m ikamesi β memelinin peptit sunumunun önemli ölçüde etkilenmediği belirtilmiştir. Bununla birlikte, heterolog β2mikroglobulin (β2m) ile karmaşık hale gelen hibrit MHC’nin metodolojisi ve teknolojisi ile ilgili sınırlı özetleme vardır. Burada MHC I çalışmasında heterolog β2m ikame fizibilitesini değerlendirme yöntemleri sunulmuştur. Bu yöntemler, ifade yapılarının hazırlanmasıni içerir; dahil etme organlarının saflaştırılması ve MHC kompleksinin yeniden katlandırılması; protein termosabilme kabiliyetinin belirlenmesi; kristal tarama ve yapı tespiti. Bu çalışma MHC I’in işlevini ve yapısını anlamak için bir öneri sağlar ve ayrıca enfeksiyöz hastalık ve tümör immünoterapisi sırasında T hücre yanıtı değerlendirmesi için de önemlidir.
Introduction
Başlıca histocompatibility complex (MHC) tüm omurgalılarda bulunur ve enfeksiyöz patojenlere karşı hücre aracılı bağışıklığı belirleyen bir gen kümesidir. MHC sınıfı I, hücresel bağışıklığa aracılık etmek ve bağışıklık düzenlemesine katılmak için CD8+ T hücrelerinin yüzeyindeki T hücre reseptörlerine (TCR) virüs enfeksiyonu üzerine üretilen viral bileşenler gibi endojen peptitler sunar1. Peptitlere bağlı MHC I’in yapısal bir çalışması, CD8+ T hücre immün yanıtlarının değerlendirilmesinde ve aşı geliştirilmesinde hayati roller oynayan MHC I moleküllerinin peptit bağlama motifleri ve sunum özellikleri hakkında bilgi sağlar.
MHC I molekülerinin Bjorkman ve ark.2tarafından ilk kristalizasyonu ve yapısal belirlenmesinden bu yana, MHC I moleküllerinin kristal yapı analizi, peptitlerin MHC I moleküllerine nasıl bağlandığı anlayışını büyük ölçüde teşvik etti ve ışık zincirlerinin ağır zincirler ve peptitlerle etkileşimini anlamaya yardımcı oldu. Bir dizi takip çalışması, ışık zincirini kodlayan genlerin MHC ile ilişkili olmamasına rağmen, ışık zincirinin MHC I moleküllerinin montajı için önemli bir protein olduğunu belirtti3,4. Birden fazla yüzeyde MHC sınıf I moleküllerinin üç alanıyla etkileşime girer. Işık zinciri olmadığında, MHC sınıfı I molekülleri antijen sunan hücrelerin yüzeyinde doğru bir şekilde ifade edilemez ve immünolojik işlevlerini uygulamak için TCR ile etkileşime giremez.
MHC I, ağır bir zincir (H zinciri) ve ışık zincirinden (yani,β 2mikroglobulinden (β2m)) oluşur ve uygun bir peptit5’ebağlanarak monte edilir. H zincirinin hücre dışı segmenti α1, α2 ve α3 etki alanlarından oluşur6. α1 ve α2 etki alanları peptit bağlama oluğunu (PBG) oluşturur. β2m zincir, MHC I’deki montaj kompleksinin yapısal bir alt birliği olarak hareket eder ve kompleksin konformasyonunu stabilize eder ve MHC I H zinciri için7, 8,9katlanan moleküler bir refakatçidir. Bir dizi çalışma, MHC I H zincirlerinin yarasa (Chiroptera) (Ptal-N * 01:01)10, rhesus makak (Primatlar) gibi çeşitli memelilerden olduğunu göstermiştir. (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, fare (Rodentia) (H-2Kd)14,15, köpek (Etobur) (DLA-88 * 50801)16, sığır (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 ve at (Peris)sodactyla) (Eqca-N*00602 ve Eqca-N*00601)18 heterologöz β2m (Tablo 1) ile birleştirebilir. Bu melez moleküller genellikle yapısal ve fonksiyonel çalışmalarda kullanılır. Bununla birlikte, hibrid MHC I’in heterolog β2m ile fonksiyonel ve yapısal çalışması için metodoloji henüz özetlenmiş değildir. Bu arada, farklı taksonlar arasındaki2m β değişim için yapısal temel belirsizliğini koruyor.
Burada MHC I ekspresyonu, yeniden katlama, kristalizasyon, kristal veri toplama ve yapı belirleme prosedürü özetlenmiştir. Ek olarak, farklı türlerden β2 m’likpotansiyel ikameleri, homolog ve heterolog β2m ile stabilize edilen MHC’nin yapısal uyumu karşılaştırılarak analiz edilir. Bu yöntemler kanser ve bulaşıcı hastalıkta daha fazla MHC I yapısal çalışması ve CD8+ T hücre immün yanıt değerlendirmesi için yardımcı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Farklı taksondan heterolog ikame yoluyla hibrit bir protein kompleksinin inşası, MHC I ve ligandlarında olduğu gibi homolog kompleks mevcut olmadığında fonksiyonel ve yapısal araştırmalar için ortak bir stratejidir. Bununla birlikte, metodoloji ve teknoloji ile ilgili sınırlı bir özet vardır. Burada bβ 2 m veya hβ 2 m ile stabilize edilen yarasa MHC I, Ptal-N*01:01’in yapısı analiz edildi. Ptal-N*01:01’e 2m’lik β bağlayıcı anahtar amino asitlerin yarasa ve insan a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Nan-jing Üniversitesi farmasötik biyoteknoloji devlet anahtar laboratuvarının açık fonu tarafından desteklendi (Grant no. KF-GN-201905), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81971501 hibeleri). William J. Liu, NSFC’nin Mükemmel Genç Bilim Adamı Programı (81822040) ve Pekin Yeni Yıldız Bilim ve Teknoloji Planı (Z181100006218080) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
- Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
- Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
- Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
- Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
- Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
- Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
- Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
- Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
- Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).
- Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
- Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
- Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
- Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
- Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
- Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
- Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
- Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
- Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
- Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
- Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
- Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
- Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
- Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).
- McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
- Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250 (2019).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).
