Протокол описывает экспериментальные методы получения стабильного крупного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I через потенциальные β 2-микроглобулин (β2 м)замены различных видов. Исследовано структурное сравнение MHC I, стабилизированное гомологичным и β2 м.
Основной комплекс гистосовместимости (MHC) играет ключевую роль в представлении пептида антигена и иммунных реакций Т-клеток против инфекционных заболеваний и развития опухоли. Гибрид MHC I, сложный с гетерологическим β 2-микроглобулин (β2 м)замена от различных видов может быть стабилизирована в пробирке. Это осуществимое средство для изучения MHC I млекопитающих, когда гомологичный β2 мнедоступен. Между тем, указывается, что β2 м заменане существенно влияет на пептидную презентацию. Тем не менее, существует ограниченное обобщение относительно методологии и технологии для гибридногоMHC I, сложного с гетерологическим β 2-микроглобулином (β2 м). В этом случае представлены методы оценки осуществимости β2 мзамены в исследовании MHC I. Эти методы включают подготовку конструкций выражения; очистка инклюзивных тел и повторное сложение комплекса МХК; определение термостабельности белка; кристаллический скрининг и определение структуры. Это исследование дает рекомендацию для понимания функции и структуры MHC I, а также имеет важное значение для оценки реакции Т-клеток во время инфекционных заболеваний и иммунотерапии опухоли.
Основной комплекс гистосовместимости (MHC) существует у всех позвоночных и является набором генов, который определяет клеточный иммунитет к инфекционным патогенам. MHC класса I представляет эндогенные пептиды, такие как вирусные компоненты, вырабатываемые при вирусной инфекции, Т-клеточных рецепторов (TCR) на поверхностиCD8 и Т-клеток для окаймляют клеточный иммунитет и участвовать в иммуннойрегуляции 1. Структурное исследование MHC I связывания с пептидами предоставляет информацию о пептидных связывающих мотивов и особенностей представления молекул MHC I, который играет жизненно важную роль в оценкеCD8 и Т-клеток иммунной реакции и разработки вакцины.
С момента первой кристаллизации и структурного определения MHC I молекулярной Bjorkman et al.2, анализ кристаллической структурымолекул MHC I значительно способствовал пониманию того, как пептиды связываются с молекулами MHC I, и помогает понять взаимодействие световых цепей с тяжелыми цепями и пептидами. Серия последующих исследований показала, что, хотя гены, кодирующие световую цепь, не связаны с MHC, световая цепь является ключевым белком для сборки молекул MHC I3,4. Он взаимодействует с тремя областями молекул класса I MHC на нескольких поверхностях. Когда световая цепь отсутствует, молекулы класса I MHC не могут быть правильно выражены на поверхности антигеносующих клеток и не могут взаимодействовать с TCR для оказания своих иммунологических функций.
MHC I состоит из тяжелой цепи (H цепи) и световой цепи (т.е. β2-микроглобулин (β2 м))и собирается через привязку к подходящемупептиду 5. Внеклеточный сегмент цепочки H состоит из доменов No1, No2 и No36. Домены No1 и No2 образуют пептидную связывающую канавку (PBG). Цепочка β2 мвыступает в качестве структурного подразделения сборочного комплекса в MHC I, стабилизирующей конформацию комплекса, и является молекулярным сопровождаем для цепи MHC I H,складываемой 7,8,9. Серия исследований показала, что MHC I H цепи из различных млекопитающих, таких как летучая мышь (Хироптера) (Ptal-N-01:01)10, резус макаки (Приматы) (Маму -Би-17)11 (Маму-АЗ01)12 (Маму-АЗ02)13, мышь (Родентия) (H-2Kd)14,15, собака (Carnivora) (DLA-88’50801)16, крупный рогатый скот (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 и лошади (Перисodactyla) (Eqca-N-00602 и Eqca-N’00601)18 может сочетаться с гетерологическими β2 м(Таблица 1). Эти гибридные молекулы часто используются в структурных и функциональных исследованиях. Однако методология функционального и структурного исследования гибридного MHC I с гетерологическим β2 мпока не обобщена. Между тем, структурная основа для взаимозаменяемых βмеждуразличными таксами остается неясной.
В этом случае суммируются процедуры выражения MHC I, повторного сплещания, кристаллизации, сбора кристаллических данных и определения структуры. Кроме того, анализируются потенциальные замены β2 му различных видов путем сравнения структурной конформации MHC I, стабилизированной гомологичным и гетерологическим β2 м. Эти методы будут полезны для дальнейшего структурного исследования MHC I и CD8 иоценки иммунного ответа Т-клеток при раке и инфекционных заболеваниях.
Строительство гибридного белкового комплекса через гетерологичную замену из различных такс является общей стратегией для функциональных и структурных исследований, когда гомологичный комплекс недоступен, например, в MHC I и его лигандах. Вместе с тем существует ограниченное обобщение…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано открытым фондом государственной ключевой лаборатории фармацевтической биотехнологии, Университет Нань-Цзин, Китай (Грант нет. KF-GN-201905), Национальный фонд естественных наук Китая (гранты 81971501). Уильям Лю поддерживается Отличной программой молодых ученых NSFC (81822040) и Пекинским новым звездным планом науки и техники (No181100006218080).
10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
APS | Sigma | A3678-100G | |
BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
GSH | Amresco | 0399-250G | |
GSSG | Amresco | 0524-100G | |
Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
NaCl | Solarbio | S8210 | |
Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 |