Stabiliteit en structuur van Vleermuis Major Histocompatibiliteit Complexe Klasse I met Heterologe β2-Microglobuline
Summary
Het protocol beschrijft experimentele methoden om stabiele grote histocompatibiliteitscomplexen (MHC) klasse I te verkrijgen door middel van mogelijke β2-microglobuline (β2m) vervangingen van verschillende soorten. De structurele vergelijking van MHC I gestabiliseerd door homologe en heterologe β2m werd onderzocht.
Abstract
Het belangrijkste histocompatibiliteitscomplex (MHC) speelt een cruciale rol in de presentatie van antigeenpeptiden en de immuunresponsen van T-cellen tegen infectieziekten en tumorontwikkeling. De hybride MHC I gecomplexeerd met heterologe β2-microglobuline (β2m) substitutie van verschillende soorten kan in vitro worden gestabiliseerd. Dit is een haalbaar middel om MHC I van zoogdieren te bestuderen, wanneer de homologe β2m niet beschikbaar is. Ondertussen is aangegeven dat zoogdier β2m substitutie geen significante invloed heeft op de presentatie van peptiden. Er is echter beperkte samenvatting met betrekking tot de methodologie en de technologie voor de hybride MHC I gecomplexeerd met heterologe β2-microglobuline (β2m). Hierin worden methoden gepresenteerd om de haalbaarheid van heterologe β2m substitutie in MHC I-studie te evalueren. Deze methoden omvatten de voorbereiding van expressieconstructies; zuivering van inclusieorganen en herindeling van het MHC-complex; bepaling van de thermostabiliteit van eiwitten; kristalscreening en structuurbepaling. Deze studie biedt een aanbeveling voor het begrijpen van de functie en structuur van MHC I, en is ook belangrijk voor de evaluatie van de T-celrespons tijdens infectieziekte en tumorimmunotherapie.
Introduction
Het belangrijkste histocompatibiliteitscomplex (MHC) bestaat in alle gewervelde dieren en is een reeks genen die de celgemedieerde immuniteit tegen infectieuze pathogenen bepaalt. MHC klasse I presenteert endogene peptiden, zoals virale componenten geproduceerd bij virusinfectie, aan T-celreceptoren (TCR) op het oppervlak van CD8+ T-cellen om cellulaire immuniteit te bemiddelen en deel te nemen aan immuunregulatie1. Een structurele studie van MHC I binding aan peptiden geeft informatie over peptidebindende motieven en presentatiekenmerken van MHC I-moleculen, die een essentiële rol spelen bij de evaluatie van CD8+ T-cel immuunresponsen en vaccinontwikkeling.
Sinds de eerste kristallisatie en structurele bepaling van MHC I moleculair door Bjorkman et al.2, heeft de kristalstructuuranalyse van MHC I-moleculen het begrip van hoe peptiden zich binden aan MHC I-moleculen sterk bevorderd en helpt het de interactie van lichte ketens met zware ketens en peptiden te begrijpen. Een reeks vervolgstudies wees uit dat hoewel de genen die coderen voor de lichtketen niet geassocieerd zijn met de MHC, de lichtketen een belangrijk eiwit is voor de assemblage van MHCI-moleculen 3,4. Het interageert met de drie domeinen van MHC klasse I moleculen op meerdere oppervlakken. Wanneer de lichtketen afwezig is, kunnen MHC-moleculen van klasse I niet correct worden uitgedrukt op het oppervlak van antigeen presenterende cellen en kunnen ze niet interageren met TCR om hun immunologische functies uit te oefenen.
MHC I bestaat uit een zware ketting (H-ketting) en lichte ketting (d.w.z. β2-microglobuline (β2m)), en wordt geassembleerd door binding aan een geschikt peptide5. Het extracellulaire segment van de H-keten bestaat uit α1-, α2- en α3-domeinen6. De domeinen α1 en α2 vormen de peptidebindende groef (PBG). De β ketting van2m fungeert als een structurele subeenheid van het assemblagecomplex in MHC I, stabiliseert de exterieur van het complex en is een moleculaire chaperonne voor MHC I H-kettingvouwen7,8,9. Een reeks studies heeft aangetoond dat MHC I H kettingen van verschillende zoogdieren zoals vleermuis (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10, rhesus macaque (Primaten) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, muis (Rodentia) (H-2Kd)14,15, hond (Carnivora) (DLA-88 *50801)16, runderen (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 en paard (Peris sodactyla) (Eqca-N*00602 en Eqca-N*00601)18 kan worden gecombineerd met heterologe β2m (tabel 1). Deze hybride moleculen worden vaak gebruikt in structurele en functionele studies. De methodologie voor de functionele en structurele studie van de hybride MHC I met heterologe β2m is echter nog niet samengevat. Ondertussen blijft de structurele basis voor de verwisselde β2m tussen verschillende taxa onduidelijk.
Hierin wordt de procedure voor MHC I-expressie, refolding, kristallisatie, kristalgegevensverzameling en structuurbepaling samengevat. Bovendien worden potentiële vervangingen van β2m van verschillende soorten geanalyseerd door vergelijking van de structurele conformiteit van MHC I gestabiliseerd door homologe en heterologe β2m. Deze methoden zullen nuttig zijn voor verdere MHC I structurele studie en CD8+ T cel immuunrespons evaluatie bij kanker en infectieziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De bouw van een hybride eiwitcomplex door heterologe vervanging van verschillende taxa is een gemeenschappelijke strategie voor functionele en structurele onderzoeken wanneer het homologe complex niet beschikbaar is, zoals in de MHC I en zijn liganden. Er is echter een beperkte samenvatting met betrekking tot de methodologie en de technologie. Hierin werd de structuur van vleermuis MHC I, Ptal-N*01:01, gestabiliseerd door bβ2m of hβ2m geanalyseerd. De belangrijkste aminozuren van β2m b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door het open fonds van het belangrijkste staatslaboratorium voor farmaceutische biotechnologie, Nan-jing University, China (Grant no. KF-GN-201905), de National Natural Science Foundation of China (subsidies 81971501). William J. Liu wordt ondersteund door het Excellent Young Scientist Program van de NSFC (81822040) en Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).
Materials
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
- Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
- Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
- Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
- Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
- Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
- Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
- Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
- Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
- Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).
- Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
- Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
- Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
- Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
- Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
- Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
- Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
- Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
- Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
- Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
- Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
- Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
- Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
- Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).
- McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
- Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250 (2019).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).
