הפרוטוקול מתאר שיטות ניסיוניות להשגת תחליפים מורכבים יציבים של היסטו-תאימות (MHC) מסוג I באמצעות β פוטנציאלייםשל 2-microglobulin (β2מ ‘) החלפות ממינים שונים. ההשוואה המבנית של MHC אני התייצב על ידי הומולוגי הטרולוגי β2מ ‘נחקרו.
מתחם ההיסטו-תאימות העיקרי (MHC) ממלא תפקיד מרכזי בהצגת פפטיד אנטיגן ותגובות חיסוניות של תאי T נגד מחלות זיהומיות והתפתחות גידולים. MHC היברידית אני מורכב עם β הטרולוגי2-microglobulin (β2מ ‘) החלפה ממינים שונים ניתן לייצב במבחנה. זהו אמצעי ריאלי ללמוד MHC I של יונקים, כאשר הומולוגי β2מ ‘אינו זמין. בינתיים, הוא הצביע על כך β יונקים2מ ‘החלפה אינה משפיעה באופן משמעותי על מצגת פפטיד. עם זאת, יש סיכום מוגבל לגבי המתודולוגיה ואת הטכנולוגיה עבור MHC היברידית אני מורכב עם β הטרולוגית2-microglobulin (β2מ ‘). להלן, מוצגות שיטות להערכת ההיתכנות של החלפה הטרולוגית β2מ ‘במחקר MHC I. שיטות אלה כוללות הכנת מבני ביטוי; טיהור גופי ההכללה וכיסוי מחדש של קומפלקס MHC; קביעת תרמו יציבות חלבון; סינון קריסטל וקביעת מבנה. מחקר זה מספק המלצה להבנת תפקוד ומבנה של MHC I, והוא גם משמעותי להערכת תגובת תאי T במהלך מחלות זיהומיות ואימונותרפיה הגידול.
קומפלקס ההיסטו-תאימות העיקרי (MHC) קיים בכל בעלי החוליות והוא קבוצה של גנים הקובעים את החסינות בתיווך התא לפתוגנים זיהומיות. MHC Class I מציג פפטידים אנדוגניים, כגון רכיבים ויראליים המיוצרים על זיהום בנגיף, לקולטנים של תאי T (TCR) על פני השטח של תאי CD8+ T כדי לתווך חסינות תאית ולהשתתף בוויסות החיסון1. מחקר מבני של MHC אני מחייב פפטידים מספק מידע לגבי מוטיבים מחייב פפטיד ותכונות מצגת על ידי מולקולות MHC I, אשר ממלא תפקידים חיוניים בהערכת תגובות חיסוניות CD8+ T תא ופיתוח חיסון.
מאז ההתגבשות הראשונה והקביעה המבנית של MHC I מולקולרית על ידי ביורקמן ואח‘2, ניתוח מבנה הגביש של מולקולות MHC I קידם מאוד את ההבנה כיצד פפטידים נקשרים למולקולות MHC I, ומסייע להבין את האינטראקציה של שרשראות אור עם שרשראות כבדות ופפטידים. סדרה של מחקרי מעקב הצביעו על כך שלמרות שהגנים המקודדים את שרשרת האור אינם קשורים ל- MHC, שרשרת האור היא חלבון מפתח להרכבת מולקולות MHC I3,4. זה אינטראקציה עם שלושת התחומים של מולקולות מסוג MHC I על משטחים מרובים. כאשר שרשרת האור נעדרת, מולקולות מסוג MHC I אינן יכולות להתבטא כראוי על פני השטח של תאים המציגים אנטיגן ואינן יכולות לקיים אינטראקציה עם TCR כדי להפעיל את הפונקציות החיסוניות שלהן.
MHC I מורכב משרשרת כבדה (שרשרת H) ושרשרת קלה (כלומר, β 2-מיקרוגלובולין (β2מ ‘)), ומורכב באמצעות כריכה לפפטידמתאים 5. המקטע החוץ-תאי של שרשרת H מורכב מתחומים α1, α2 ו- α36. התחומים α1 ו α2 יוצרים את חריץ מחייב פפטיד (PBG). שרשרת β2מ ‘משמשת כקומוניט מבני של מתחם ההרכבה ב- MHC I, מייצבת את הקונפורמציה של המתחם, והיא מלווה מולקולרית עבור שרשרת MHC I H המתקפלת7,8,9. סדרה של מחקרים הראו כי MHC I H שרשראות מיונקים שונים כגון עטלף (כירופטרה) (Ptal-N * 01:01)10, מקוק רזוס (פרימטים) (Mamu-B *17)11 (Mamu-A *01)12 (Mamu-A *02)13, עכבר (מכרסם) (H-2Kd)14,15, כלב (קרניבורה) (DLA-88 * 50801)16, בקר (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 וסוסים (פריסodactyla) (Eqca-N * 00602 ו Eqca-N * 00601)18 יכול לשלב עם β הטרולוגי2מ ‘(טבלה 1). מולקולות היברידיות אלה משמשות לעתים קרובות במחקרים מבניים ותפקודיים. עם זאת, המתודולוגיה למחקר הפונקציונלי והמבני של ה- MHC I ההיברידי עם βהטרולוגית 2מ ‘עדיין לא סוכמה. בינתיים, הבסיס המבני למחלף β 2 מ’ביןמסות שונות עדיין לא ברור.
להלן, ההליך עבור ביטוי MHC אני, refolding, התגבשות, איסוף נתוני קריסטל וקביעת מבנה מסוכמים. בנוסף, תחליפים פוטנציאליים של β2מ ‘ממינים שונים מנותחים באמצעות השוואת הקונפורמציה המבנית של MHC אני התייצב על ידי הומולוגית הטרולוגית β2מ ‘. שיטות אלה יהיה מועיל למחקר מבני נוסף MHC אני CD8+ T תאים תגובה חיסונית הערכה בסרטן ומחלות זיהומיות.
בניית קומפלקס חלבונים היברידי באמצעות החלפה הטרולוגית ממסה שונה היא אסטרטגיה נפוצה לחקירות תפקודיות ומבניות כאשר המתחם ההומולוגי אינו זמין, כגון ב- MHC I ובליגנדים שלו. עם זאת, יש סיכום מוגבל לגבי המתודולוגיה והטכנולוגיה. להלן, המבנה של בת MHC אני, Ptal-N * 01:01, התייצב על ידי bβ2m או hβ2מ ‘…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הפתוחה של מעבדת מפתח המדינה של ביוטכנולוגיה פרמצבטית, אוניברסיטת נאן-ג’ינג, סין (גרנט לא. KF-GN-201905), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענקים 81971501). ויליאם ג’יי ליו נתמך על ידי תוכנית המדען הצעיר המצוינת של NSFC (81822040) ובייג’ינג תוכנית כוכב חדש של מדע וטכנולוגיה (Z181100006218080).
10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
APS | Sigma | A3678-100G | |
BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
GSH | Amresco | 0399-250G | |
GSSG | Amresco | 0524-100G | |
Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
NaCl | Solarbio | S8210 | |
Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 |