ב Vivo הקלטה תאית של מוטונורון עמוד השדרה חולדה מזוהה סוג במהלך גירוי זרם ישיר טרנס-עמוד השדרה
Summary
פרוטוקול זה מתאר בהקלטה תאית vivo של motoneurons מותני חולדה עם גירוי זרם ישיר טרנס-עמוד השדרה בו זמנית. השיטה מאפשרת לנו למדוד תכונות קרום ולתעד ירי קצבי של motoneurons לפני, במהלך ואחרי קיטוב אנודל או קטודלי של חוט השדרה.
Abstract
הקלטה תאית של מוטונורונים בעמוד השדרה ב-vivo מספקת “תקן זהב” לקביעת המאפיינים האלקטרופיזיולוגיים של התאים ברשת עמוד השדרה השלמה ומחזיקה ביתרונות משמעותיים ביחס לטכניקות הקלטה קלאסיות במבחנה או בהקלטה חוץ-תאית. היתרון של הקלטות תאיות vivo הוא כי שיטה זו יכולה להתבצע על בעלי חיים בוגרים עם מערכת עצבים בוגרת לחלוטין, ולכן מנגנונים פיזיולוגיים רבים שנצפו ניתן לתרגם ליישומים מעשיים. בנייר מתודולוגי זה, אנו מתארים הליך זה בשילוב עם גירוי זרם קבוע מיושם חיצונית, המחקה תהליכי קיטוב המתרחשים בתוך רשתות עצביות בעמוד השדרה. גירוי זרם ישיר טרנס-עמוד השדרה (tsDCS) היא שיטה חדשנית המשמשת יותר ויותר כהתערבות נוירומודולטיבית בשיקום לאחר פציעות נוירולוגיות שונות, כמו גם בספורט. ההשפעה של tsDCS על מערכת העצבים נותרה מובנת היטב והמנגנונים הפיזיולוגיים מאחורי פעולותיה אינם ידועים ברובם. היישום של tsDCS בו זמנית עם הקלטות תאיות מאפשר לנו לבחון ישירות שינויים של תכונות קרום motoneuron ומאפיינים של ירי קצבי בתגובה לקיטוב של הרשת העצבית בעמוד השדרה, אשר חיוני להבנת פעולות TsDCS. יתר על כן, כאשר הפרוטוקול המוצג כולל זיהוי של motoneuron ביחס לשריר הפנימי ותפקודו (flexor לעומת extensor) כמו גם את הסוג הפיזיולוגי (מהיר לעומת איטי) הוא מספק הזדמנות לחקור באופן סלקטיבי את ההשפעה של tsDCS על רכיבים מזוהים של מעגלים בעמוד השדרה, אשר נראה מושפע באופן שונה על ידי קיטוב. ההליך המוצג מתמקד בהכנה כירורגית להקלטות תאיות וגירוי בדגש על הצעדים הנחוצים להשגת יציבות הכנה ושחזור של תוצאות. הפרטים של המתודולוגיה של יישום tsDCS אנודל או קטטודלי נדונים תוך מתן תשומת לב לבעיות מעשיות ובטיחותיות.
Introduction
גירוי זרם ישיר טרנס-עמוד השדרה (tsDCS) צובר הכרה כשיטה חזקה כדי לשנות את עירור מעגל השדרה בבריאותומחלות 1,,2,,3. בטכניקה זו, זרם קבוע מועבר בין אלקטרודה פעילה הממוקמת מעל מקטעים נבחרים בעמוד השדרה, עם אלקטרודה הפניה הממוקמת באופן גחיד או יותר rostrally4. מספר מחקרים כבר אישרו כי tsDCS יכול לשמש בניהול תנאים פתולוגיים מסוימים,כגון כאב נוירופתי 5, ספסטיות6, פגיעה בחוטהשדרה 7 או כדי להקל עלשיקום 8. החוקרים מציעים כי tsDCS מעורר שינויים בהתפלגות היונים בין המרחב התוך תאי לבין החלל החוץ-תאי על פני קרום התא, וזה יכול להקל או לעכב פעילות עצבית בהתאם לכיווןהנוכחי 9,10,11. עם זאת, עד לאחרונה, היה חסר אישור ישיר להשפעה זו על המוטוניונים.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לנהל הקלטה תאית vivo של פוטנציאל חשמלי מmotoneurons עמוד השדרה המותני בחולדה מרדים עם יישום בו זמנית של tsDCS, על מנת לצפות בשינויים קרום motoneuron ומאפייני ירי בתגובה קיטוב anodal או קטודלי של הרשת העצבית בעמוד השדרה. הקלטות תאיות פותחות מספר תחומי חקירה של מאפייני נוירון, שאינן זמינות לטכניקות חוץ-תאיותשהיו בשימוש בעבר 9,12. לדוגמה, ניתן למדוד במדויק את תגובת מתח קרום המוטון לזרימת זרם ישירה המושרה על-ידי tsDCS, כדי לציין סף מתח עבור יצירת ספייק, או לנתח פרמטרים פוטנציאליים של פעולה. יתר על כן, טכניקה זו מאפשרת לנו לקבוע תכונות קרום פסיבי motoneuron, כגון התנגדות קלט, ולקנות את הקשר בין זרם גירוי תאי ותדירות של ירי קצבי של motoneurons. זיהוי נוגדני של מוטון מוקלט, המבוסס על גירוי של עצבים המזוהים באופן פונקציונלי (כלומר, עצבים המספקים אפרטנטים כיפוף או מורטים) מאפשר לנו לזהות בנוסף סוגים של יחידות מנוע פנימיות (מהיר לעומת איטי), אשר נותן הזדמנות לבדוק אם קיטוב משפיע באופן שונה על אלמנטים בודדים של מערכת העצבים של עמוד השדרה הבוגר. בשל ניתוח מקיף לפני ההקלטה ודרישות גבוהות על יציבות ואמינות של הקלטות, טכניקה זו היא מאתגרת מאוד אך מאפשרת הערכה ישירה וארוך טווח של מאפיינים אלקטרופיזיולוגיים של motoneuron אחד: לפני, במהלך ואחרי יישום של tsDCS, אשר חיוני כדי לקבוע הן את פעולותיה אקוטיות והשפעותמתמידות 13. כמו motoneuron ישירות מפעיל סיבי שריר extrafusal14 ולוקח חלק בשליטה משוב של התכווצות שרירים ופיתח כוח15,16 כל השפעה נצפתה של tsDCS על יחידת המנוע או תכונות שריר מתכווץ עשוי להיות קשור אפנון של מוטונורון עירור או מאפייני ירי.
Protocol
Representative Results
Discussion
אם תבוצע כראוי, יש להשלים את החלק הכירורגי של הפרוטוקול המתואר בתוך כשלוש שעות. יש לנקוט טיפול מיוחד בשמירה על מצבים פיזיולוגיים יציבים של בעל חיים במהלך הניתוח, בפרט טמפרטורת הגוף ועומק ההרדמה. מלבד שיקולים אתיים ברורים, חוסר הרדמה נכונה יכול לגרום לתנועות גפיים מוגזמות במהלך כריתת עצב א?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מרכז המדע הלאומי מס’ 2017/25/B/NZ7/00373. המחברים רוצים להכיר את עבודתם של חנה Drzymała-Celichowska ו Włodzimierz Mrówczyński, אשר שניהם תרמו איסוף נתונים וניתוח של התוצאות המוצגות בעיתון זה.
Materials
| Durgs and solutions | – | – | – |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | – | – |
| Glucose | Merck | 346351 | – |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | – |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | – | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Puławy Sp. z o.o | – | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | – |
| Tetraspan | Braun | – | HES solution |
| Surgical equipment | – | – | – |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | – |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | – |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | – |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | – | – | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | – |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | – |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | – | – | – |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | – |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | – |
| Equipment | – | – | – |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | – | – | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | – | – | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | – | – | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | – | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | – | – | – |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | – | – | – |
| flexible tubing | – | – | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | – | – | For nerve electrodes |
References
- Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).
- Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance. PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).
- Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level. Neuroscience. 393, 150-163 (2018).
- Parazzini, M., et al. Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS). Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).
- Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury. Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).
- Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects. The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).
- de Araújo, A. V. L., et al. Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis. Spinal Cord. , (2020).
- de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).
- Ahmed, Z. Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity. Physiological Reports. 4 (3), (2016).
- Bolzoni, F., Jankowska, E. Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations. The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).
- Cogiamanian, F., et al. Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation. Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).
- Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat. The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system’s final pathway. Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).
- Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior. Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).
- Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions. Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).
- Gardiner, P. F. Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms. Physiological Reports. 2 (9), (2014).
- Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).
- Bączyk, M., Jankowska, E. Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats. Journal of Applied Physiology. 126 (5), 1232-1241 (2019).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats. European Journal of Neuroscience. , (2019).
- Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. The Journal of Physiology. 557, 175-190 (2004).
- Jankowska, E. Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).
- Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones. The Journal of Physiology. 573, 663-677 (2006).
