Enregistrement intracellulaire in vivo des motoneurones spinaux de rat identifiés par type pendant la stimulation trans-spinale à courant direct
Summary
Ce protocole décrit l’enregistrement intracellulaire in vivo des motoneurons lombaires de rat avec la stimulation simultanée de courant direct trans-spinal. La méthode nous permet de mesurer les propriétés de la membrane et d’enregistrer le tir rythmique des motoneurons avant, pendant et après la polarisation anodale ou cathodale de la moelle épinière.
Abstract
L’enregistrement intracellulaire des motoneurones spinaux in vivo fournit une « norme d’or » pour déterminer les caractéristiques électrophysiologiques des cellules dans le réseau spinal intact et détient des avantages significatifs par rapport aux techniques classiques d’enregistrement in vitro ou extracellulaire. Un avantage des enregistrements intracellulaires in vivo est que cette méthode peut être effectuée sur des animaux adultes avec un système nerveux entièrement mature, et donc de nombreux mécanismes physiologiques observés peuvent être traduits à des applications pratiques. Dans cet article méthodologique, nous décrivons cette procédure combinée avec la stimulation de courant constant appliquée à l’extérieur, qui imite les processus de polarisation se produisant dans les réseaux neuronaux spinaux. La stimulation trans-spinale à courant continu (tsDCS) est une méthode novatrice de plus en plus utilisée comme intervention neuromodulatoire en réadaptation après diverses lésions neurologiques ainsi que dans le sport. L’influence du tsDCS sur le système nerveux reste mal comprise et les mécanismes physiologiques derrière ses actions sont largement inconnus. L’application du tsDCS simultanément avec des enregistrements intracellulaires nous permet d’observer directement les changements des propriétés de la membrane du motoneuron et les caractéristiques de la cuisson rythmique en réponse à la polarisation du réseau neuronal de la colonne vertébrale, ce qui est crucial pour la compréhension des actions tsDCS. En outre, lorsque le protocole présenté inclut l’identification du motoneuron en ce qui concerne un muscle innervé et sa fonction (fléchisseur contre extenseur) ainsi que le type physiologique (rapide par rapport à lent), il fournit l’occasion d’étudier sélectivement l’influence de tsDCS sur les composants identifiés des circuits rachidiens, qui semblent être affectés différemment par la polarisation. La procédure présentée se concentre sur la préparation chirurgicale pour les enregistrements intracellulaires et la stimulation en mettant l’accent sur les étapes qui sont nécessaires pour atteindre la stabilité de préparation et la reproductibilité des résultats. Les détails de la méthodologie de l’application anodal ou cathodal tsDCS sont discutés tout en prêtant attention aux questions pratiques et de sécurité.
Introduction
La stimulation trans-spinale à courant direct (tsDCS) gagne en reconnaissance comme méthode puissante pour modifier l’excitabilité du circuit spinal dans la santé et la maladie1,2,3. Dans cette technique, un courant constant est passé entre une électrode active située au-dessus de segments de la colonne vertébrale sélectionnés, avec une électrode de référence située soit ventrally ou plus rostrally4. Plusieurs études ont déjà confirmé que tsDCS peut être utilisé dans la gestion de certaines conditions pathologiques, telles que la douleur neuropathique5, spasticité6, lésion de la moelle épinière7 ou pour faciliter la réadaptation8. Les chercheurs suggèrent que le tsDCS évoque des altérations de la distribution des ions entre l’espace intracellulaire et l’espace extracellulaire à travers la membrane cellulaire, ce qui peut faciliter ou inhiber l’activité neuronale en fonction de l’orientation actuelle9,10,11. Cependant, jusqu’à récemment, il manquait une confirmation directe de cette influence sur les motoneurons.
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour mener l’enregistrement intracellulaire in vivo des potentiels électriques des motoneurones lombaires spinaux dans le rat anesthésié avec application simultanée de tsDCS, afin d’observer des changements dans la membrane de motoneuron et les propriétés de tir en réponse à la polarisation anodale ou cathodale du réseau neuronal spinal. Les enregistrements intracellulaires ouvrent plusieurs domaines d’investigation des propriétés des neurones, non disponibles pour les techniques extracellulaires précédemment utilisées9,12. Par exemple, il est possible de mesurer avec précision la réponse de la tension de la membrane motoneuron au flux de courant direct induit par tsDCS, d’indiquer le seuil de tension pour la génération de pointes ou d’analyser les paramètres potentiels d’action. En outre, cette technique nous permet de déterminer les propriétés de la membrane passive motoneuron, telles que la résistance aux entrées, et d’observer la relation entre le courant de stimulation intracellulaire et la fréquence de tir rythmique des motoneurons. L’identification antidromique du motoneuron enregistré, basée sur la stimulation des nerfs fonctionnellement identifiés (c.-à-d. les nerfs fournissant des efferents aux fléchisseurs ou aux extenseurs) nous permet d’identifier en outre les types d’unités motrices innervés (rapides ou lentes), ce qui donne l’occasion de tester si la polarisation influence différemment les éléments individuels du système neuronal rachidien mature. En raison d’une intervention chirurgicale étendue précédant l’enregistrement et des exigences élevées en matière de stabilité et de fiabilité des enregistrements, cette technique est très difficile, mais permet une évaluation directe et à long terme des caractéristiques électrophysiologiques d’un motoneuron : avant, pendant et après l’application de tsDCS, ce qui est crucial pour déterminer à la fois ses actions aiguës et ses effets persistants13. Comme un motoneuron active directement les fibres musculaires extrafusales14 et prend part au contrôle de rétroaction d’une contraction musculaire et a développé la force15,16 toute influence observée de tsDCS sur l’unité motrice ou les propriétés contractiles musculaires peuvent être liées à des modulations de l’excitation motoneuron ou des caractéristiques de tir.
Protocol
Representative Results
Discussion
S’il est exécuté correctement, la partie chirurgicale du protocole décrit doit être complétée dans un délai d’environ trois heures. Il faut prendre un soin particulier dans le maintien des conditions physiologiques stables d’un animal pendant la chirurgie, en particulier la température corporelle et la profondeur de l’anesthésie. Outre les considérations éthiques évidentes, un manque d’anesthésie appropriée peut entraîner des mouvements excessifs des membres pendant la dissection nerveuse ou lami…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par la subvention du National Science Center no 2017/25/B/NZ7/00373. Les auteurs souhaitent reconnaître le travail de Hanna Drzymała-Celichowska et Włodzimierz Mrówczyński, qui ont tous deux contribué à la collecte et à l’analyse des données des résultats présentés dans cet article.
Materials
| Durgs and solutions | – | – | – |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | – | – |
| Glucose | Merck | 346351 | – |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | – |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | – | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Puławy Sp. z o.o | – | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | – |
| Tetraspan | Braun | – | HES solution |
| Surgical equipment | – | – | – |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | – |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | – |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | – |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | – | – | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | – |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | – |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | – | – | – |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | – |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | – |
| Equipment | – | – | – |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | – | – | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | – | – | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | – | – | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | – | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | – | – | – |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | – | – | – |
| flexible tubing | – | – | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | – | – | For nerve electrodes |
References
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