В Vivo внутриклеточной записи тип-идентифицированных крыс спинного мотонейронов во время транс-спинного прямого тока стимуляции
Summary
Этот протокол описывает внутриклеточную запись внутриклеточной записи крысиных поясничных мотонейронов с одновременным транс-спинномозговой стимуляцией прямого тока. Метод позволяет измерять мембранные свойства и записывать ритмическую стрельбу мотонейронов до, во время и после анодальной или катодальной поляризации спинного мозга.
Abstract
Внутриклеточная запись спинномозговых мотонейронов in vivo обеспечивает «золотой стандарт» для определения электрофизиологических характеристик клеток в нетронутой спинальной сети и имеет значительные преимущества по сравнению с классическими методами экстракорпоральной или внеклеточной записи. Преимущество внутриклеточных записей in vivo заключается в том, что этот метод может быть выполнен на взрослых животных с полностью зрелой нервной системой, и поэтому многие наблюдаемые физиологические механизмы могут быть переведены на практическое применение. В этой методологической работе мы описываем эту процедуру в сочетании с внешне применяемой постоянной текущей стимуляцией, которая имитирует процессы поляризации, происходящие в спинномозговых нейронных сетях. Транс-спинальной стимуляции прямого тока (tsDCS) является инновационным методом все чаще используется в качестве нейромодуляторного вмешательства в реабилитации после различных неврологических травм, а также в спорте. Влияние tsDCS на нервную систему остается плохо понятым и физиологические механизмы, стоящие за его действиями, в значительной степени неизвестны. Применение tsDCS одновременно с внутриклеточными записями позволяет нам непосредственно наблюдать изменения свойств мотонейронной мембраны и характеристик ритмической стрельбы в ответ на поляризацию сети спинного нейрона, что имеет решающее значение для понимания действий цДЦ. Кроме того, когда представленный протокол включает в себя идентификацию мотонейрона в отношении иннерватной мышцы и ее функции (сгибатель против экстенсора), а также физиологический тип (быстрый и медленный), он дает возможность выборочно исследовать влияние tsDCS на выявленные компоненты спинномозговой цепи, которые, как представляется, по-разному зависит от поляризации. Представленная процедура посвящена хирургической подготовке к внутриклеточным записям и стимуляции с акцентом на шаги, необходимые для достижения стабильности подготовки и воспроизводимости результатов. Детали методологии анодального или катодального применения tsDCS обсуждаются, обращая внимание на практические вопросы и вопросы безопасности.
Introduction
Транс-спинальной стимуляции прямого тока (tsDCS) получает признание в качестве мощного метода для изменения возбудимости спинномозговой цепив здоровье и болезни 1,2,3. В этом методе, постоянный ток передается между активным электродом, расположенным над выбранными сегментами позвоночника, со эталонным электродом, расположенным либо вентрально, либо болеерострально 4. Несколько исследований уже подтвердили, что tsDCS может быть использован в управлении определенными патологическими состояниями, такими какневропатическая боль 5,спастичность 6,повреждениеспинного мозга 7 или для облегченияреабилитации 8. Исследователи предполагают, что tsDCS вызывает изменения в распределении ионов между внутриклеточным и внеклеточным пространством через клеточную мембрану, и это может либо облегчить или ингибировать нейронной активности в зависимости оттекущей ориентации 9,10,11. Однако до недавнего времени прямого подтверждения этого влияния на мотонейроны не было.
Здесь мы описываем подробный протокол для проведения внутриклеточной записи внутриклеточной записи электрических потенциалов поясничных позвоночных мотонейронов в анестезированной крысе с одновременным применением цДКС, для того, чтобы наблюдать изменения в мотонейронной мембране и огневых свойствах в ответ на анодальную или катодную поляризацию спинальной нейрональной сети. Внутриклеточные записи открывают несколько областей исследования свойств нейронов, недоступных для ранее использованных внеклеточныхметодов 9,,12. Например, можно точно измерить реакцию напряжения мотонейроновой мембраны на прямой поток тока, индуцированный tsDCS, указать порог напряжения для генерации шипов или проанализировать потенциальные параметры действия. Кроме того, этот метод позволяет определить мотонейронные пассивные мембранные свойства, такие как входное сопротивление, и наблюдать связь между внутриклеточным тоном стимуляции и частотой ритмичной стрельбы мотонейронов. Антидромная идентификация записанного мотонейрона, основанная на стимуляции функционально идентифицированных нервов (т.е. нервов, обеспечивающих эфференты сгибателям или разгибателям), позволяет дополнительно определить типы иннерватных моторных агрегатов (быстрых и медленных), что дает возможность проверить, влияет ли поляризация по-разному на отдельные элементы зрелой спинномозговой нейронной системы. В связи с обширной хирургией, предшествующей записи, и высокими требованиями к стабильности и надежности записей, этот метод является весьма сложным, но позволяет проводить прямую и долгосрочную оценку электрофизиологических характеристик одного мотонейрона: до, во время и после применения tsDCS, что имеет решающее значение для определения как его острых действий, так истойких эффектов 13. Как motoneuron непосредственно активирует внефусальные мышечныеволокна 14 и принимает участие в контроле обратной связи сокращения мышц и развитойсилы 15,16 любое наблюдаемое влияние tsDCS на двигательный блок или мышечные контрактильные свойства могут быть связаны с модуляциями мотонейрона возбудимость или огневые характеристики.
Protocol
Representative Results
Discussion
При правильной работе хирургическая часть описанного протокола должна быть завершена в течение примерно трех часов. Особо следует позаботиться о поддержании стабильных физиологических условий животного во время операции, в частности температуры тела и глубины анестезии. Помимо очев…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Национального научного центра No 2017/25/B/N’7/00373. Авторы хотели бы признать работу Ханны Дзымаши-Челиховской и Влодзимьежа Мравчински, которые внесли свой вклад в сбор и анализ результатов, представленных в настоящем документе.
Materials
| Durgs and solutions | – | – | – |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | – | – |
| Glucose | Merck | 346351 | – |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | – |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | – | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Puławy Sp. z o.o | – | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | – |
| Tetraspan | Braun | – | HES solution |
| Surgical equipment | – | – | – |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | – |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | – |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | – |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | – | – | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | – |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | – |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | – | – | – |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | – |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | – |
| Equipment | – | – | – |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | – | – | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | – | – | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | – | – | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | – | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | – | – | – |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | – | – | – |
| flexible tubing | – | – | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | – | – | For nerve electrodes |
References
- Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).
- Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance. PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).
- Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level. Neuroscience. 393, 150-163 (2018).
- Parazzini, M., et al. Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS). Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).
- Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury. Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).
- Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects. The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).
- de Araújo, A. V. L., et al. Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis. Spinal Cord. , (2020).
- de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).
- Ahmed, Z. Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity. Physiological Reports. 4 (3), (2016).
- Bolzoni, F., Jankowska, E. Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations. The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).
- Cogiamanian, F., et al. Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation. Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).
- Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat. The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system’s final pathway. Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).
- Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior. Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).
- Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions. Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).
- Gardiner, P. F. Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms. Physiological Reports. 2 (9), (2014).
- Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).
- Bączyk, M., Jankowska, E. Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats. Journal of Applied Physiology. 126 (5), 1232-1241 (2019).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats. European Journal of Neuroscience. , (2019).
- Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. The Journal of Physiology. 557, 175-190 (2004).
- Jankowska, E. Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).
- Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones. The Journal of Physiology. 573, 663-677 (2006).
