Bu protokol, eşzamanlı trans-spinal doğru akım stimülasyonu ile sıçan lomber motoneurons in vivo hücre içi kayıt açıklar. Bu yöntem, omuriliğin anodal veya kahodal polarizasyonuöncesinde, sırasında ve sonrasında motononların ritmik ateşlemesini kaydetmemizi sağlar.
In vivo spinal motoneurons hücre içi kayıt bozulmamış spinal ağ hücrelerin elektrofizyolojik özelliklerini belirlemek için bir “altın standart” sağlar ve klasik in vitro veya hücre dışı kayıt teknikleri göre önemli avantajlar alametleri vardır. In vivo hücre içi kayıtların bir avantajı, bu yöntemin tamamen olgun bir sinir sistemine sahip yetişkin hayvanlar üzerinde yapIlebilmektedir ve bu nedenle gözlenen birçok fizyolojik mekanizma pratik uygulamalara çevrilebilir. Bu metodolojik yazıda, spinal nöronal ağlarda meydana gelen polarizasyon süreçlerini taklit eden dışa uygulanan sürekli akım stimülasyonu ile birlikte bu prosedürü açıklıyoruz. Trans-spinal doğru akım stimülasyonu (tsDCS) giderek çeşitli nörolojik yaralanmalar dan sonra rehabilitasyon da nöromodülatör bir müdahale olarak kullanılan yenilikçi bir yöntemdir yanı sıra spor. TSDCS’nin sinir sistemi üzerindeki etkisi tam olarak anlaşılamamıştır ve eylemlerinin arkasındaki fizyolojik mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. TSDCS’nin hücre içi kayıtlarla eş zamanlı olarak uygulanması, tsDCS eylemlerinin anlaşılması için çok önemli olan spinal nöronal ağın polarizasyonuna yanıt olarak motonöron membran özelliklerinin ve ritmik ateşleme özelliklerinin değişimini doğrudan gözlemlememizi sağlar. Ayrıca, sunulan protokol bir innerve kas ve fonksiyonu (fleksör karşı ekstansör) yanı sıra fizyolojik türü (hızlı karşı yavaş) açısından motoneuron belirlenmesi ni içerdiğinde seçici olarak spinal devre, farklı kutuplaşma etkilenmiş gibi görünüyor spinal devre nin tanımlanmış bileşenleri üzerinde tsDCS etkisini araştırmak için bir fırsat sağlar. Sunulan prosedür, hazırlık stabilitesi ve sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için gerekli olan adımlarüzerinde durularak hücre içi kayıtlar ve stimülasyon için cerrahi hazırlık üzerine odaklanmaktadır. Pratik ve güvenlik konularına dikkat edilirken anodal veya katodal tsDCS uygulamasının metodolojisinin ayrıntıları tartışılır.
Trans-spinal doğru akım stimülasyonu (tsDCS) sağlık ve hastalık1spinal devre uyarılabilirlik değiştirmek için güçlü bir yöntem olarak tanıma kazanıyor1,2,3. Bu teknikte, seçilen spinal segmentlerin üzerinde bulunan aktif bir elektrot arasında sabit bir akım geçirilir, ventrally veya daharostrally4 bulunan bir referans elektrot ile. Çeşitli çalışmalar zaten tsDCS bazı patolojik koşulların yönetiminde kullanılabilir doğruladı, nöropatik ağrı gibi5, spastisite6, omurilik yaralanması7 veya rehabilitasyon kolaylaştırmak için8. Araştırmacılar tsDCS hücre içi ve hücre zarı boyunca hücre içi ve hücre dışı uzay arasındaki iyon dağılımıdeğişiklikleri çağrıştırıyor öneririz, ve9bu ya kolaylaştırmak veya mevcut oryantasyon abağlı olarak nöronal aktiviteyi inhibe 9,10,11. Ancak, yakın zamana kadar, motoneurons üzerinde bu etkiyi doğrudan bir onay eksikti.
Burada, tsDCS eşzamanlı uygulama ile anestezili sıçan lomber spinal motoneurons elektrik selülozlarının in vivo hücre içi kayıt yapmak için ayrıntılı bir protokol açıklar, spinal nöronal ağın anodal veya kahodal polarizasyon yanıt olarak motonöron membran değişiklikleri gözlemlemek ve ateşleme özellikleri. Hücre içi kayıtlar nöron özellikleri nin araştırılması çeşitli alanlarda açık, daha önce kullanılan hücre dışı teknikler için kullanılamaz9,12. Örneğin, tsDCS tarafından indüklenen doğru akım akışına motoneuron membran gerilim tepkisini tam olarak ölçmek, ani üretim için gerilim eşiğini belirtmek veya eylem potansiyeli parametrelerini analiz etmek mümkündür. Ayrıca, bu teknik bize girdap direnci gibi motoneuron pasif membran özelliklerini belirlemek için izin verir, ve intrahücresel stimülasyon akımı ve motoneurons ritmik ateş sıklığı arasındaki ilişkiyi gözlemlemek için. Kayıtlı motoneuron antidromik tanımlama, fonksiyonel olarak tanımlanmış sinirlerin uyarılmasıdayalı (yani, fleksörveya ekstansörler efferents sağlayan sinirler) bize ekselvaya motor birimlerinin türlerini belirlemenize olanak sağlar (hızlı karşı yavaş), polarizasyon farklı olgun spinal nöronal sistemin bireysel unsurları etkiler olup olmadığını test etmek için bir fırsat verir. Kayıt tan önce kapsamlı bir ameliyat ve kayıtların stabilite ve güvenilirlik yüksek gereksinimleri nedeniyle, bu teknik son derece zor ama bir motoneuron elektrofizyolojik özellikleridoğrudan ve uzun vadeli değerlendirilmesi sağlar: önce, sırasında ve tsDCS uygulamadan sonra, hangi akut eylemleri ve kalıcı etkileri belirlemek için çok önemlidir13. Bir motoneuron doğrudan ekstrafusal kas lifleri aktive olarak14 ve bir kas kasılması geribildirim kontrolünde yer alır ve geliştirilen kuvvet15,16 motor ünitesi veya kas kontraktil özellikleri üzerinde tsDCS herhangi bir gözlenen etkisi motoneuron uyarılabilirlik veya ateş özellikleri modülasyonları ile bağlantılı olabilir.
Doğru yapılırsa, tanımlanan protokolün cerrahi kısmı yaklaşık üç saat içinde tamamlanmalıdır. Ameliyat sırasında bir hayvanın stabil fizyolojik durumunun korunmasına özellikle vücut ısısı ve anestezi derinliği ne kadar özen li olmak gerekir. Bariz etik hususlarDışında, uygun anestezi eksikliği sinir diseksiyonu veya laminektomi sırasında aşırı ekstremite hareketlerine neden olabilir ve hazırlık veya erken deney sonlandırma hasara yol açabilir. Bir hayvanı mikroelektrotla omuriliğe …
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma 2017/25/B/NZ7/00373 sayılı Ulusal Bilim Merkezi hibesi ile desteklenmiştir. Yazarlar Hanna Drzymała-Celichowska ve Włodzimierz Mrówczyński, her ikisi de veri toplama ve bu makalede sunulan sonuçların analizi katkıda çalışmalarını tanımak istiyorum.
Durgs and solutions | – | – | – |
Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | – | – |
Glucose | Merck | 346351 | – |
NaHCO3 | Merck | 106329 | – |
Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | – | Neuromuscular blocker |
Pentobarbital sodium | Biowet Puławy Sp. z o.o | – | Main anesthetic agent |
Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | – |
Tetraspan | Braun | – | HES solution |
Surgical equipment | – | – | – |
21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
Cauterizer | FST | 18010-00 | – |
Chest Tubes | Mila | CT1215 | – |
Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
Hemostat | FST | 13013-14 | – |
Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
Tracheal tube | – | – | Custom made |
Vein catheter | Vygon | 1261.201 | – |
Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | – |
Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
Sugrgical materials | – | – | – |
Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | – |
Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | – |
Equipment | – | – | – |
Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
Microdrive | – | – | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
Support frame | – | – | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
Spinal clamps | – | – | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
TP-1 DC stimulator | WiNUE | – | tsDCS stimulator |
Miscellaneous | – | – | – |
1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
Cotton wool | – | – | – |
flexible tubing | – | – | For respirator and CO2 analyzer connection |
MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
Silver wire | – | – | For nerve electrodes |