Summary

Trans-Spinal Doğrudan Akım Stimülasyonu Sırasında Tip-Tanımlanmış Sıçan Spinal Motoneurons In Vivo Hücre İçi Kayıt

Published: May 11, 2020
doi:

Summary

Bu protokol, eşzamanlı trans-spinal doğru akım stimülasyonu ile sıçan lomber motoneurons in vivo hücre içi kayıt açıklar. Bu yöntem, omuriliğin anodal veya kahodal polarizasyonuöncesinde, sırasında ve sonrasında motononların ritmik ateşlemesini kaydetmemizi sağlar.

Abstract

In vivo spinal motoneurons hücre içi kayıt bozulmamış spinal ağ hücrelerin elektrofizyolojik özelliklerini belirlemek için bir “altın standart” sağlar ve klasik in vitro veya hücre dışı kayıt teknikleri göre önemli avantajlar alametleri vardır. In vivo hücre içi kayıtların bir avantajı, bu yöntemin tamamen olgun bir sinir sistemine sahip yetişkin hayvanlar üzerinde yapIlebilmektedir ve bu nedenle gözlenen birçok fizyolojik mekanizma pratik uygulamalara çevrilebilir. Bu metodolojik yazıda, spinal nöronal ağlarda meydana gelen polarizasyon süreçlerini taklit eden dışa uygulanan sürekli akım stimülasyonu ile birlikte bu prosedürü açıklıyoruz. Trans-spinal doğru akım stimülasyonu (tsDCS) giderek çeşitli nörolojik yaralanmalar dan sonra rehabilitasyon da nöromodülatör bir müdahale olarak kullanılan yenilikçi bir yöntemdir yanı sıra spor. TSDCS’nin sinir sistemi üzerindeki etkisi tam olarak anlaşılamamıştır ve eylemlerinin arkasındaki fizyolojik mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. TSDCS’nin hücre içi kayıtlarla eş zamanlı olarak uygulanması, tsDCS eylemlerinin anlaşılması için çok önemli olan spinal nöronal ağın polarizasyonuna yanıt olarak motonöron membran özelliklerinin ve ritmik ateşleme özelliklerinin değişimini doğrudan gözlemlememizi sağlar. Ayrıca, sunulan protokol bir innerve kas ve fonksiyonu (fleksör karşı ekstansör) yanı sıra fizyolojik türü (hızlı karşı yavaş) açısından motoneuron belirlenmesi ni içerdiğinde seçici olarak spinal devre, farklı kutuplaşma etkilenmiş gibi görünüyor spinal devre nin tanımlanmış bileşenleri üzerinde tsDCS etkisini araştırmak için bir fırsat sağlar. Sunulan prosedür, hazırlık stabilitesi ve sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için gerekli olan adımlarüzerinde durularak hücre içi kayıtlar ve stimülasyon için cerrahi hazırlık üzerine odaklanmaktadır. Pratik ve güvenlik konularına dikkat edilirken anodal veya katodal tsDCS uygulamasının metodolojisinin ayrıntıları tartışılır.

Introduction

Trans-spinal doğru akım stimülasyonu (tsDCS) sağlık ve hastalık1spinal devre uyarılabilirlik değiştirmek için güçlü bir yöntem olarak tanıma kazanıyor1,2,3. Bu teknikte, seçilen spinal segmentlerin üzerinde bulunan aktif bir elektrot arasında sabit bir akım geçirilir, ventrally veya daharostrally4 bulunan bir referans elektrot ile. Çeşitli çalışmalar zaten tsDCS bazı patolojik koşulların yönetiminde kullanılabilir doğruladı, nöropatik ağrı gibi5, spastisite6, omurilik yaralanması7 veya rehabilitasyon kolaylaştırmak için8. Araştırmacılar tsDCS hücre içi ve hücre zarı boyunca hücre içi ve hücre dışı uzay arasındaki iyon dağılımıdeğişiklikleri çağrıştırıyor öneririz, ve9bu ya kolaylaştırmak veya mevcut oryantasyon abağlı olarak nöronal aktiviteyi inhibe 9,10,11. Ancak, yakın zamana kadar, motoneurons üzerinde bu etkiyi doğrudan bir onay eksikti.

Burada, tsDCS eşzamanlı uygulama ile anestezili sıçan lomber spinal motoneurons elektrik selülozlarının in vivo hücre içi kayıt yapmak için ayrıntılı bir protokol açıklar, spinal nöronal ağın anodal veya kahodal polarizasyon yanıt olarak motonöron membran değişiklikleri gözlemlemek ve ateşleme özellikleri. Hücre içi kayıtlar nöron özellikleri nin araştırılması çeşitli alanlarda açık, daha önce kullanılan hücre dışı teknikler için kullanılamaz9,12. Örneğin, tsDCS tarafından indüklenen doğru akım akışına motoneuron membran gerilim tepkisini tam olarak ölçmek, ani üretim için gerilim eşiğini belirtmek veya eylem potansiyeli parametrelerini analiz etmek mümkündür. Ayrıca, bu teknik bize girdap direnci gibi motoneuron pasif membran özelliklerini belirlemek için izin verir, ve intrahücresel stimülasyon akımı ve motoneurons ritmik ateş sıklığı arasındaki ilişkiyi gözlemlemek için. Kayıtlı motoneuron antidromik tanımlama, fonksiyonel olarak tanımlanmış sinirlerin uyarılmasıdayalı (yani, fleksörveya ekstansörler efferents sağlayan sinirler) bize ekselvaya motor birimlerinin türlerini belirlemenize olanak sağlar (hızlı karşı yavaş), polarizasyon farklı olgun spinal nöronal sistemin bireysel unsurları etkiler olup olmadığını test etmek için bir fırsat verir. Kayıt tan önce kapsamlı bir ameliyat ve kayıtların stabilite ve güvenilirlik yüksek gereksinimleri nedeniyle, bu teknik son derece zor ama bir motoneuron elektrofizyolojik özellikleridoğrudan ve uzun vadeli değerlendirilmesi sağlar: önce, sırasında ve tsDCS uygulamadan sonra, hangi akut eylemleri ve kalıcı etkileri belirlemek için çok önemlidir13. Bir motoneuron doğrudan ekstrafusal kas lifleri aktive olarak14 ve bir kas kasılması geribildirim kontrolünde yer alır ve geliştirilen kuvvet15,16 motor ünitesi veya kas kontraktil özellikleri üzerinde tsDCS herhangi bir gözlenen etkisi motoneuron uyarılabilirlik veya ateş özellikleri modülasyonları ile bağlantılı olabilir.

Protocol

Bu protokole bağlı tüm prosedürler ilgili makamlar (örneğin, Yerel Etik Komitesi) tarafından kabul edilmiş ve hayvan refahı ve yönetimi ile ilgili ulusal ve uluslararası kurallara uyulması. NOT: Prosedüre katılan her katılımcının temel cerrahi işlemler konusunda doğru şekilde eğitilmesi ve hayvan deneyleri yapmak için geçerli bir lisansa sahip olması gerekir. 1. Anestezi ve premedication Sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksi…

Representative Results

Etki potansiyellerinin parametreleri ve çeşitli membran özellikleri, hücre penetrasyonunun istikrarlı koşulları sağlandığında hücre içi kayıtlar temelinde hesaplanabilir. Şekil 1A, hücre içi stimülasyonun uyardığı tipik bir ortopedik etki potansiyeli sunar ve bu da veri dahil etme için tüm kriterleri karşılar (en az -50 mV’lik istirahat membran potansiyeli ve 50 mV’den yüksek olan ani genlik, pozitif bir overshoot ile). Ani genlik, hiperpolarizasyon genliği veya hi…

Discussion

Doğru yapılırsa, tanımlanan protokolün cerrahi kısmı yaklaşık üç saat içinde tamamlanmalıdır. Ameliyat sırasında bir hayvanın stabil fizyolojik durumunun korunmasına özellikle vücut ısısı ve anestezi derinliği ne kadar özen li olmak gerekir. Bariz etik hususlarDışında, uygun anestezi eksikliği sinir diseksiyonu veya laminektomi sırasında aşırı ekstremite hareketlerine neden olabilir ve hazırlık veya erken deney sonlandırma hasara yol açabilir. Bir hayvanı mikroelektrotla omuriliğe …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma 2017/25/B/NZ7/00373 sayılı Ulusal Bilim Merkezi hibesi ile desteklenmiştir. Yazarlar Hanna Drzymała-Celichowska ve Włodzimierz Mrówczyński, her ikisi de veri toplama ve bu makalede sunulan sonuçların analizi katkıda çalışmalarını tanımak istiyorum.

Materials

Durgs and solutions
Atropinum sulfuricum Polfa Warszawa
Glucose Merck 346351
NaHCO3 Merck 106329
Pancuronium Jelfa PharmaSwiss/Valeant Neuromuscular blocker
Pentobarbital sodium Biowet Puławy Sp. z o.o Main anesthetic agent
Pottasium citrate Chempur 6100-05-06
Tetraspan Braun HES solution
Surgical equipment
21 Blade FST 10021-00 Scalpel blade
Cauterizer FST 18010-00
Chest Tubes Mila CT1215
Dumont #4 Forceps FST 11241-30 Muscle forceps
Dumont #5 Forceps FST 11254-20 Dura forceps
Dumont #5F Forceps FST 11255-20 Nerve forceps
Dumont #5SF Forceps FST 11252-00 Pia forceps
Forceps FST 11008-13 Blunt forceps
Forceps FST 11053-10 Skin forceps
Hemostat FST 13013-14
Rongeur FST 16021-14 For laminectomy
Scissors FST 15000-08 Vein scissors
Scissors FST 15002-08 Dura scissors
Scissors FST 14184-09 For trachea cut
Scissors FST 104075-11 Muscle scissors
Scissors FST 14002-13 Skin scissors
Tracheal tube Custom made
Vein catheter Vygon 1261.201
Vessel cannulation forceps FST 18403-11
Vessel clamp FST 18320-11 For vein clamping
Vessel Dilating Probe FST 10160-13 For vein dissection
Sugrgical materials
Gel foam Pfizer GTIN 00300090315085 Hemostatic agent
Silk suture 4.0 FST 18020-40
Silk suture 6.0 FST 18020-60
Equipment
Axoclamp 2B Molecular devices discontinued Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A
CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor CWE 11-10000 Gas analyzer
Grass S-88 A-M Systems discontinued Constant current stimulator
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe Harvard Apparatus 507222F Heating system
ISO-DAM8A WPI 74020 Extracellular amplifier
Microdrive Custom made/replacement IVM/Scientifica
P-1000 Microelectrode puller Sutter Instruments P-1000 Microelectrode puller
SAR-830/AP Small Animal Ventilator CWE 12-02100 Respirator
Support frame Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting
Spinal clamps Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting
TP-1 DC stimulator WiNUE tsDCS stimulator
Miscellaneous
1B150-4 glass capillaries WPI 1B150-4 For microelectrodes production
Cotton wool
flexible tubing For respirator and CO2 analyzer connection
MicroFil WPI MF28G67-5 For filling micropipettes
Silver wire For nerve electrodes

References

  1. Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).
  2. Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance. PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).
  3. Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level. Neuroscience. 393, 150-163 (2018).
  4. Parazzini, M., et al. Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS). Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).
  5. Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury. Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).
  6. Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects. The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).
  7. de Araújo, A. V. L., et al. Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis. Spinal Cord. , (2020).
  8. de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).
  9. Ahmed, Z. Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity. Physiological Reports. 4 (3), (2016).
  10. Bolzoni, F., Jankowska, E. Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations. The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).
  11. Cogiamanian, F., et al. Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation. Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).
  12. Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).
  13. Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat. The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).
  14. Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system’s final pathway. Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).
  15. Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior. Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).
  16. Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions. Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).
  17. Gardiner, P. F. Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).
  18. Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms. Physiological Reports. 2 (9), (2014).
  19. Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).
  20. Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).
  21. Bączyk, M., Jankowska, E. Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).
  22. Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats. Journal of Applied Physiology. 126 (5), 1232-1241 (2019).
  23. Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats. European Journal of Neuroscience. , (2019).
  24. Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).
  25. Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).
  26. Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. The Journal of Physiology. 557, 175-190 (2004).
  27. Jankowska, E. Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).
  28. Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones. The Journal of Physiology. 573, 663-677 (2006).

Play Video

Cite This Article
Bączyk, M., Krutki, P. In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation. J. Vis. Exp. (159), e61439, doi:10.3791/61439 (2020).

View Video