In Vivo intracellulaire opname van type-geïdentificeerde Rat Spinal Motoneurons tijdens trans-spinale directe stroomstimulatie
Summary
Dit protocol beschrijft in vivo intracellulaire opname van rat lumbale motoneurons met gelijktijdige trans-spinale directe stroom stimulatie. De methode stelt ons in staat om membraaneigenschappen te meten en ritmisch afvuren van motoneurons op te nemen voor, tijdens en na anodale of kathodale polarisatie van het ruggenmerg.
Abstract
Intracellulaire opname van spinale motoneurons in vivo biedt een “gouden standaard” voor het bepalen van de elektrofysiologische kenmerken van de cellen in het intacte spinale netwerk en heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van klassieke in vitro of extracellulaire opnametechnieken. Een voordeel van in vivo intracellulaire opnames is dat deze methode kan worden uitgevoerd op volwassen dieren met een volledig volwassen zenuwstelsel, en daarom kunnen veel waargenomen fysiologische mechanismen worden vertaald naar praktische toepassingen. In dit methodologisch papier beschrijven we deze procedure in combinatie met extern toegepaste constante stroomstimulatie, die polarisatieprocessen in spinale neuronale netwerken nabootst. Trans-spinale directe stroomstimulatie (tsDCS) is een innovatieve methode die steeds vaker wordt gebruikt als een neuromodulatory interventie in revalidatie na verschillende neurologische verwondingen en in de sport. De invloed van tsDCS op het zenuwstelsel blijft slecht begrepen en de fysiologische mechanismen achter zijn acties zijn grotendeels onbekend. De toepassing van de tsDCS gelijktijdig met intracellulaire opnames stelt ons in staat om veranderingen van motoneuron membraaneigenschappen en kenmerken van ritmisch vuren direct waar te nemen in reactie op de polarisatie van het spinale neuronale netwerk, wat cruciaal is voor het begrijpen van tsDCS-acties. Bovendien, wanneer het gepresenteerde protocol de identificatie van de motoneuron met betrekking tot een innervated spier en zijn functie (flexor versus extensor) evenals het fysiologische type (snel versus langzaam) omvat, biedt het een kans om selectief de invloed van tsDCS op geïdentificeerde componenten van spinale circuits te onderzoeken, die anders lijken te worden beïnvloed door polarisatie. De gepresenteerde procedure richt zich op chirurgische voorbereiding voor intracellulaire opnames en stimulatie met de nadruk op de stappen die nodig zijn om voorbereidingsstabiliteit en reproduceerbaarheid van de resultaten te bereiken. De details van de methodologie van de anodale of kathodale tsDCS applicatie worden besproken met aandacht voor praktische en veiligheidskwesties.
Introduction
Trans-spinale directe stroomstimulatie (tsDCS) krijgt erkenning als een krachtige methode om spinale circuit excitability in gezondheid en ziekte1,2,3te wijzigen . In deze techniek wordt een constante stroom doorgegeven tussen een actieve elektrode boven geselecteerde spinale segmenten, met een referentieelektrode die ventrally of meer rostrally4bevindt. Verschillende studies hebben al bevestigd dat tsDCS kan worden gebruikt bij het beheer van bepaalde pathologische aandoeningen, zoals neuropathische pijn5,spasticiteit6,dwarslaesie7 of om revalidatie te vergemakkelijken8. Onderzoekers suggereren dat tsDCS veranderingen oproept in de ionenverdeling tussen de intracellulaire en de extracellulaire ruimte over het celmembraan, en dit kan de neuronale activiteit vergemakkelijken of remmen, afhankelijk van de huidige oriëntatie9,10,11. Tot voor kort ontbrak echter een directe bevestiging van deze invloed op motoneurons.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om in vivo intracellulaire registratie van elektrische potentialen van lumbale spinale motoneurons in de verdoofde rat uit te voeren met gelijktijdige toepassing van tsDCS, om veranderingen in motoneuronmembraan en afvurende eigenschappen in reactie op anodale of kathodale polarisatie van het spinale neuronale netwerk waar te nemen. Intracellulaire opnamen openen verschillende onderzoeksgebieden van neuroneigenschappen, niet beschikbaar voor eerder gebruikte extracellulaire technieken9,12. Het is bijvoorbeeld mogelijk om de reactie van motoneuronmembraanspanning op gelijkstroomstroom veroorzaakt door tsDCS nauwkeurig te meten, om de spanningsdrempel voor piekgeneratie aan te geven of om actiepotentieelparameters te analyseren. Bovendien stelt deze techniek ons in staat om de passieve membraaneigenschappen van motoneuron te bepalen, zoals invoerweerstand, en om de relatie tussen intracellulaire stimulatiestroom en frequentie van ritmisch afvuren van motoneurons te observeren. Antidromische identificatie van geregistreerde motoneuron, gebaseerd op de stimulatie van functioneel geïdentificeerde zenuwen (d.w.z. zenuwen die efferents leveren aan flexoren of extensoren) stelt ons in staat om bovendien soorten innervated motoreenheden te identificeren (snel versus langzaam), wat een kans geeft om te testen of polarisatie op verschillende manieren individuele elementen van het volwassen spinale neuronale systeem beïnvloedt. Vanwege een uitgebreide operatie voorafgaand aan de opname en hoge eisen aan stabiliteit en betrouwbaarheid van opnames, is deze techniek zeer uitdagend, maar maakt een directe en langdurige beoordeling van elektrofysiologische kenmerken van één motoneuron mogelijk: voor, tijdens en na toepassing van tsDCS, wat cruciaal is om zowel de acute acties als de aanhoudende effecten te bepalen13. Als een motoneuron activeert direct extrafusale spiervezels14 en neemt deel aan feedback controle van een spiercontractie en ontwikkelde kracht15,16 elke waargenomen invloed van tsDCS op de motorische eenheid of spier contractiele eigenschappen kunnen worden gekoppeld aan modulaties van motoneuron excitability of vuren kenmerken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Indien correct uitgevoerd, moet het chirurgische deel van het beschreven protocol binnen ongeveer drie uur worden voltooid. Men moet bijzondere zorg in het handhaven van stabiele fysiologische omstandigheden van een dier tijdens de operatie, met name lichaamstemperatuur en diepte van anesthesie. Afgezien van duidelijke ethische overwegingen, een gebrek aan de juiste anesthesie kan leiden tot overmatige bewegingen van ledematen tijdens zenuwdissectie of laminectomie en leiden tot schade aan de voorbereiding of een voortij…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Science Center subsidie Nr. 2017/25/B/NZ7/00373. De auteurs willen het werk erkennen van Hanna Drzymała-Celichowska en Włodzimierz Mrówczyński, die beide hebben bijgedragen aan het verzamelen van gegevens en de analyse van de resultaten die in dit document worden gepresenteerd.
Materials
| Durgs and solutions | – | – | – |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | – | – |
| Glucose | Merck | 346351 | – |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | – |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | – | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Puławy Sp. z o.o | – | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | – |
| Tetraspan | Braun | – | HES solution |
| Surgical equipment | – | – | – |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | – |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | – |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | – |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | – | – | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | – |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | – |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | – | – | – |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | – |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | – |
| Equipment | – | – | – |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | – | – | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | – | – | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | – | – | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | – | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | – | – | – |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | – | – | – |
| flexible tubing | – | – | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | – | – | For nerve electrodes |
References
- Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).
- Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance. PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).
- Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level. Neuroscience. 393, 150-163 (2018).
- Parazzini, M., et al. Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS). Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).
- Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury. Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).
- Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects. The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).
- de Araújo, A. V. L., et al. Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis. Spinal Cord. , (2020).
- de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).
- Ahmed, Z. Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity. Physiological Reports. 4 (3), (2016).
- Bolzoni, F., Jankowska, E. Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations. The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).
- Cogiamanian, F., et al. Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation. Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).
- Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat. The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system’s final pathway. Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).
- Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior. Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).
- Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions. Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).
- Gardiner, P. F. Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms. Physiological Reports. 2 (9), (2014).
- Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).
- Bączyk, M., Jankowska, E. Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats. Journal of Applied Physiology. 126 (5), 1232-1241 (2019).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats. European Journal of Neuroscience. , (2019).
- Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. The Journal of Physiology. 557, 175-190 (2004).
- Jankowska, E. Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).
- Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones. The Journal of Physiology. 573, 663-677 (2006).
