Summary

生体内でのトランス脊髄直流刺激時の型同定されたラット脊髄モネニューロンの細胞内記録

Published: May 11, 2020
doi:

Summary

このプロトコルは、同時のトランス脊髄直流刺激を用いたラット腰椎モトニューロンの生体内細胞内記録について説明する。この方法により、膜の特性を測定し、脊髄のアノーダルまたは陰極分極化の前後にモトニューロンのリズミカルな発火を記録することができます。

Abstract

生体内の脊髄モトニューロンの細胞内記録は、無傷の脊髄ネットワークにおける細胞の電気生理学的特徴を決定するための「ゴールドスタンダード」を提供し、古典的なインビトロまたは細胞外記録技術に対して有意な利点を有する。生体内細胞内記録の利点は、完全に成熟した神経系を持つ成体動物に対してこの方法を行うことができることであり、したがって、多くの観察された生理学的メカニズムを実用的なアプリケーションに翻訳することができる。この方法論的論文では、この手順を、脊髄神経ネットワーク内で起こる偏光プロセスを模倣する外部応用定電流刺激と組み合わせて説明する。トランス脊髄直流刺激(tsDCS)は、様々な神経学的傷害の後のリハビリテーションにおける神経調節的介入として、またスポーツにおいてますます使用される革新的な方法である。tsDCSが神経系に及ぼす影響は未だに解明されておらず、その作用の背後にある生理学的メカニズムはほとんど知られていない。tsDCSを細胞内記録と同時に応用することで、脊髄神経回路網の分極化に応じて、モトニューロン膜の性質やリズミカルな発火の特性の変化を直接観察することができ、tsDCSの作用を理解するために重要です。さらに、提示されたプロトコルに、内在筋とその機能(屈筋対伸長器)に関するモトニューロンの同定と生理学的タイプ(速い対低速)が含まれる場合、分極によって異なる影響を受けると思われる脊髄回路の同定された成分に対するtsDCSの影響を選択的に調査する機会を提供する。提示された手順は、細胞内の記録のための外科的調製と、結果の調製の安定性と再現性を達成するために必要なステップに重点を置いて刺激に焦点を当てています。アノーダルまたは陰極tsDCSアプリケーションの方法論の詳細は、実用的かつ安全上の問題に注意を払いながら議論される。

Introduction

トランス脊髄直流刺激(tsDCS)は、健康と疾患,1、2、32における脊髄回路興奮性を修飾する1強力な方法として認識を得ている。3この技術では、選択した脊髄セグメントの上に位置する活性電極の間に一定の電流が渡され、参照電極は腹側またはより多くのロストレル4に位置する。いくつかの研究は、tsDCSが神経因性疼痛5、痙攣性6、脊髄損傷7、またはリハビリテーションを促進するために、特定の病的状態の管理に使用できることを既に確認している。研究者は、tsDCSが細胞膜を横切る細胞内および細胞外空間との間のイオン分布の変化を誘発することを示唆しており、これは現在の向き9、10、1110,9応じて神経活動を促進または阻害することができる。11しかし、最近まで、モトニューロンに対するこの影響の直接的な確認は欠けていた。

ここでは、ニューロン脊髄ネットワークのアノダルまたは陰極偏光に応答してモトニューロン膜および発火特性の変化を観察するために、麻酔付きラットの腰椎脊髄モトニューロンからの電気電位の記録を生体内で行う詳細なプロトコルについて説明する。細胞内記録は、ニューロンの特性の調査のいくつかの領域を開き、以前に使用された細胞外技術99、1212のために利用できない。例えば、tsDCSによって誘導される直接電流流れに対するモトニューロン膜電圧応答を正確に測定し、スパイク発生の電圧閾値を示したり、アクション電位パラメータを解析したりすることができる。また、この技術により、入力抵抗などのモトニューロン受動膜特性を判断し、細胞内刺激電流とモトニューロンのリズミカルな発火頻度との関係を観察することができます。記録されたモトニューロンの抗ドロミック同定は、機能的に同定された神経(すなわち、屈筋または伸長器にエフェレントを提供する神経)の刺激に基づいて、さらに内在性運動ユニットの種類(速い対低速)を同定することを可能にし、分極が成熟した脊髄神経系の個々の要素に異なる影響を与えるかどうかをテストする機会を与える。記録の安定性と信頼性に関する記録および高い要件に先行する広範な手術のために、この技術は非常に困難であるが、1つのモトニューロンの電気生理学的特性の直接的かつ長期的な評価を可能にする:tsDCSの適用前、適用中および適用後、その急性作用および持続効果の両方を決定するために重要である13。モトニューロンが直接筋筋線維14を活性化し、筋収縮および発達力15のフィードバック制御に関与するように、16は運動部または筋肉収縮特性に対するtsDCSの観察された影響は、モトニューロンの興奮性または発火特性の変調にリンクされ得る。,

Protocol

この議定書に関連するすべての手続きは、適切な当局(例えば、地域倫理委員会)によって受け入れられ、動物の福祉と管理に関する国内および国際的な規則に従っています。 注:手順に関与する各参加者は、基本的な外科的処置で適切に訓練され、動物実験を行うための有効なライセンスを持っている必要があります。 1. 麻酔と前投薬 ペント?…

Representative Results

細胞浸透の安定した条件が確保された場合、作用電位およびいくつかの膜特性のパラメータは、細胞内記録に基づいて計算することができる。 図1Aは 、細胞内刺激によって誘発される典型的な正交性作用電位を示し、データ包含のすべての基準(少なくとも-50 mVの静止膜電位、および50mVより高いスパイク振幅、陽性のオーバーシュート)を満たす。スパイク振幅、後偏波…

Discussion

正しく行われれば、記載されたプロトコルの外科部分は約3時間以内に完了するべきである。手術中の動物の安定した生理的状態、特に体温や麻酔の深さを維持する上で特に注意する必要があります。明らかな倫理的配慮とは別に、適切な麻酔の欠如は、神経解剖または解剖の間に過度の四肢の動きを引き起こし、準備または早期実験終了の損傷につながる可能性があります。脊髄を微小電極…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、国立科学センター補助金第2017/25/B/NZ7/00373によって支援されました。著者らは、この論文で提示された結果のデータ収集と分析に貢献したハンナ・ドジマワ・チェリコフスカとヴウォジミミェシュ・ムロフチンスキの研究を認識したいと考えています。

Materials

Durgs and solutions
Atropinum sulfuricum Polfa Warszawa
Glucose Merck 346351
NaHCO3 Merck 106329
Pancuronium Jelfa PharmaSwiss/Valeant Neuromuscular blocker
Pentobarbital sodium Biowet Puławy Sp. z o.o Main anesthetic agent
Pottasium citrate Chempur 6100-05-06
Tetraspan Braun HES solution
Surgical equipment
21 Blade FST 10021-00 Scalpel blade
Cauterizer FST 18010-00
Chest Tubes Mila CT1215
Dumont #4 Forceps FST 11241-30 Muscle forceps
Dumont #5 Forceps FST 11254-20 Dura forceps
Dumont #5F Forceps FST 11255-20 Nerve forceps
Dumont #5SF Forceps FST 11252-00 Pia forceps
Forceps FST 11008-13 Blunt forceps
Forceps FST 11053-10 Skin forceps
Hemostat FST 13013-14
Rongeur FST 16021-14 For laminectomy
Scissors FST 15000-08 Vein scissors
Scissors FST 15002-08 Dura scissors
Scissors FST 14184-09 For trachea cut
Scissors FST 104075-11 Muscle scissors
Scissors FST 14002-13 Skin scissors
Tracheal tube Custom made
Vein catheter Vygon 1261.201
Vessel cannulation forceps FST 18403-11
Vessel clamp FST 18320-11 For vein clamping
Vessel Dilating Probe FST 10160-13 For vein dissection
Sugrgical materials
Gel foam Pfizer GTIN 00300090315085 Hemostatic agent
Silk suture 4.0 FST 18020-40
Silk suture 6.0 FST 18020-60
Equipment
Axoclamp 2B Molecular devices discontinued Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A
CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor CWE 11-10000 Gas analyzer
Grass S-88 A-M Systems discontinued Constant current stimulator
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe Harvard Apparatus 507222F Heating system
ISO-DAM8A WPI 74020 Extracellular amplifier
Microdrive Custom made/replacement IVM/Scientifica
P-1000 Microelectrode puller Sutter Instruments P-1000 Microelectrode puller
SAR-830/AP Small Animal Ventilator CWE 12-02100 Respirator
Support frame Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting
Spinal clamps Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting
TP-1 DC stimulator WiNUE tsDCS stimulator
Miscellaneous
1B150-4 glass capillaries WPI 1B150-4 For microelectrodes production
Cotton wool
flexible tubing For respirator and CO2 analyzer connection
MicroFil WPI MF28G67-5 For filling micropipettes
Silver wire For nerve electrodes

References

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Cite This Article
Bączyk, M., Krutki, P. In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation. J. Vis. Exp. (159), e61439, doi:10.3791/61439 (2020).

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