Chick Ciliary Ganglion Nöronların İzolasyon ve Kültür
Summary
Chick siliker gangliyonu (CG) parasempatik sinir sisteminin bir parçasıdır. Civciv CG nöronların nöronal kültürlersinir kas etkileşimleri çalışmada etkili hücre modelleri olduğu gösterilmiştir. Biz diseksiyon, dissosilasyon ve civciv embriyolarından CG nöronların in vitro kültür için ayrıntılı bir protokol açıklar.
Abstract
Chick siliary gangliyonu (CG) parasempatik sinir sisteminin bir parçasıdır ve gözde mevcut kas dokularının innervasyonu sorumludur. Bu ganglion striated ve düz kas lifleri innerve silikya ve koroidal nöronların homojen bir popülasyon tarafından oluşturulan, sırasıyla. Bu nöronal tiplerin her biri belirli göz yapılarını ve fonksiyonlarını düzenler. Yıllar içinde, civciv silikya gangliyonu nöronal kültürlerkas-sinir sistemi etkileşimleri çalışmada etkili hücre modelleri olduğu gösterilmiştir, hangi kolinerjik sinapslar yoluyla iletişim. Siliary ganglion nöronlar, çoğunluğu, kolinerjik vardır. Bu hücre modeli kolinerjik yanı sıra, çeşitli nöronal türleri oluşturan daha önce kullanılan heterojen hücre modelleri için nispeten yararlı olduğu gösterilmiştir. Anatomik olarak, siliyer ganglion optik sinir arasında lokalize (ON) ve koroid fissür (CF). Burada civciv embriyolarından silyary gangliyon nöronların diseksiyon, dissosilasyon ve in vitro kültürü için ayrıntılı bir prosedür açıklıyoruz. CG nöronların son derece saf ve istikrarlı hücresel kültürleri elde etmek için adım adım protokol sağlayarak sürecin önemli adımlarını vurguluyoruz. Bu kültürler 15 gün boyunca in vitro olarak korunabilir ve bu vesileyle, CG kültürlerin normal gelişimini gösterir. Sonuçlar da bu nöronlar nöro-müsküler kolinerjik sinapslar yoluyla kas lifleri ile etkileşime girebilirsiniz göstermektedir.
Introduction
Siliary ganglion (CG) nöronlar parasempatik sinir sistemine aittir. Bu nöronlar kolinerjik, muskarinik veya nikotinik sinaps lar kurmak mümkün olmak1,2,3. Anatomik olarak, CG optik sinir (ON) ve koroid fissür (CF) arasında gözün arka kısmında bulunan ve erken embriyonik aşamalarında yaklaşık 6000 nöronoluşur1,4. Kültürde ilk hafta, siliary ganglion nöronlar multipolar morfolojisi mevcut. Bir hafta sonra, tek kutuplu bir duruma geçmeye başlarlar, bir neurite uzaması ve akson5’ioluşturması ile. Buna ek olarak, CG nöronların yaklaşık yarısı piliç embriyo gelişiminin 8ve 14 gün arasında, hücre ölümü programlanmış bir süreç yoluyla ölür. Yaklaşık 3000 nöronların siliya ganglion toplam nüfus adabı nöron ların sayısındaki bu azalma6,7,8. In vitro, kas hücreleri ile yetiştirilen CG nöronların sayısında azalma yoktur9 ve CG nöronlar birkaç hafta için kültüre edilebilir1,9.
Siliyer ganglion siliyer nöronlar ve koroidal nöronların homojen bir popülasyon oluşur, Her CG nöronal popülasyonun yarısını temsil eden, göz kas innerve. Bu iki tip nöron yapısal, anatomik ve işlevsel olarak farklıdır. Siliary nöronlar iris ve lens üzerinde triated kas lifleri innerve, gözbebeği kasılması sorumlu olmak. Koroidal nöronlar koroid,1,10,11,,12düz kas innerve .,
Tavuk siliyer ganglion nöronların Kültürler nöromüsküler sinaps ve sinaps oluşumu,1,5,9çalışma için yararlı araçlar olduğu gösterilmiştir. Nöromüsküler sinapslar kolinerjik olduğunu göz önünde bulundurarak13, kolinerjik bir nöronal popülasyon kullanarak – CG nöronlar – önceki hücre modelleri için potansiyel bir alternatif olarak ortaya çıktı14. Bu modeller heterojen nöronal popülasyondan oluşuyordu, bu da sadece küçük bir kısmı kolinerjik. Alternatif olarak, siliyer ganglion nöronlar nispeten hızlı in vitro geliştirmek, ve yaklaşık 15 saat sonra zaten sinaps formu1. CG nöronlar farklı araştırma çalışmaları için yıllar boyunca bir model sistemi olarak kullanılmıştır, izolasyon ve manipülasyon nispeten kolaylığı nedeniyle. Bu uygulamalar optogenetik çalışmalar, sinaps gelişimi, apoptoz ve nöromüsküler etkileşimleriiçerir 14,15.
Biz embriyonik gün 7 (E7) civciv embriyolarından silyary gangliyon nöronların diseksiyon, dissosilasyon ve in vitro kültür için ayrıntılı bir prosedür açıklar. Kolinerjik nöronların son derece saf ve istikrarlı hücresel kültürleri elde etmek için adım adım protokol sağlıyoruz. Ayrıca, özel dikkat gerektiren ve nöronal kültürlerin kalitesini artıracak protokolün önemli adımlarını da vurguluyoruz. Bu kültürler en az 15 gün boyunca in vitro muhafaza edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde CG nöronlarının nasıl hazırlanacağını ve kültürlendirilebildiğini gösterdik. Siliyer ganglion tanımlama ve diseksiyon deneyimsiz kullanıcılar için zor olabilir. Bu nedenle, E7 civciv siliyer gangliyonu verimli bir şekilde diseksiyon, doku ayrıştırmak ve en az 15 gün boyunca muhafaza edilebilir nöronal kültürler hazırlamak için ayrıntılı ve adım adım prosedür salıyoruz. Bu protokol ile elde edilen silyary ganglion nöronlar da kas hücreleri ile co-kültür için uygundur.</p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE projeleri kapsamında Centro 2020 Bölgesel Operasyonel Programı aracılığıyla Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF) tarafından finanse edilerek finanse edilebilmektedir. CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS ve COMPETE 2020 – FCT üzerinden Rekabet ve Uluslararasılaşma için Operasyonel Program ve Portekiz ulusal fonları – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., uidb/04539/2020 projeleri kapsamında, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008 ve bireysel hibeLer SFRH/BD/141092/20 118 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) ve Marie Curie Actions tarafından – IRG, 7.
Materials
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
References
- Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
- Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Developmental Biology. 28, 407-429 (1972).
- Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
- Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
- Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
- Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
- Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
- Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
- Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
- Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
- Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
- Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
- Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
- Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
- Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
- Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
- Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
- Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
- Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
- Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
- Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
- Squire, L. R. . Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
- Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
- Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
- Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).
