Isolation und Kultur von Chick Ciliary Ganglion Neurons
Summary
Küken-Ziliarganglien (CG) sind Teil des parasympathischen Nervensystems. Neuronale Kulturen von Küken CG Neuronen wurden gezeigt, dass effektive Zellmodelle in der Studie der Nervenmuskel-Interaktionen. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Zerlegung, Dissoziation und In-vitro-Kultur von CG-Neuronen aus Kükenembryonen.
Abstract
Küken Ziliarganglien (CG) sind Teil des parasympathischen Nervensystems und sind verantwortlich für die Innervation der Muskelgewebe im Auge vorhanden. Dieses Ganglion besteht aus einer homogenen Population von Ziliar- und Aderhautneuronen, die die muskelfasern inneren und glatten Muskelfasern bilden. Jeder dieser neuronalen Typen reguliert spezifische Augenstrukturen und Funktionen. Im Laufe der Jahre zeigten sich neuronale Kulturen der Küken-Ziliarganglien als wirksame Zellmodelle bei der Untersuchung von Muskel-Nerven-System-Wechselwirkungen, die durch cholinerge Synapsen kommunizieren. Ziliarganglien-Neuronen sind in ihrer Mehrheit cholinerge. Dieses Zellmodell hat sich als nützlich für bisher verwendete heterogene Zellmodelle erwiesen, die neben cholinergen verschiedene neuronale Typen umfassen. Anatomisch wird das Ziliarganglien zwischen dem Sehnerv (ON) und der Aderhautspalte (CF) lokalisiert. Hier beschreiben wir ein detailliertes Verfahren für die Zerlegung, Dissoziation und In-vitro-Kultur von Ziliarganglien-Neuronen aus Kükenembryonen. Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um hochreine und stabile Zellkulturen von CG-Neuronen zu erhalten, wobei die wichtigsten Schritte des Prozesses hervorgehoben werden. Diese Kulturen können 15 Tage lang in vitro gepflegt werden und zeigen damit die normale Entwicklung von CG-Kulturen. Die Ergebnisse zeigen auch, dass diese Neuronen mit Muskelfasern durch neuromuskuläre cholinerge Synapsen interagieren können.
Introduction
Ziliarganglion (CG) Neuronen gehören zum parasympathischen Nervensystem. Diese Neuronen sind cholinerg, in der Lage, muscarinische oder nikotinische Synapsen1,2,3. Anatomisch befindet sich die CG im hinteren Teil des Auges zwischen dem Sehnerv (ON) und der Aderhautspalte (CF) und besteht aus rund 6000 Neuronen in frühen embryonalen Stadien1,4. Für die erste Kulturwoche präsentieren Ziliarganglien-Neuronen eine multipolare Morphologie. Nach einer Woche beginnen sie, in einen unipolaren Zustand überzusteigen, wobei sich ein Neurit ausdehnt und das Axon5bildet. Darüber hinaus stirbt etwa die Hälfte der CG-Neuronen zwischen dem8. und14. Tag der Entwicklung von Kükenembryonen durch einen programmierten Prozess des Zelltodes. Dieser Rückgang der Anzahl der Neuronen führt zu einer Gesamtpopulation des Ziliarganglien von etwa 3000 Neuronen6,7,8. In vitro, Es gibt keine Verringerung der Anzahl der CG Neuronen, wenn mit Muskelzellen9 und CG Neuronen wachsen kann für mehrere Wochen kultiviert werden1,9.
Das Ziliarganglie besteht aus einer homogenen Population von Ziliarneuronen und Aderhautneuronen, die jeweils die Hälfte der neuronalen Population in der CG darstellen und den Muskel des Auges innervieren. Diese beiden Arten von Neuronen sind strukturell, anatomisch und funktionell unterschiedlich. Ziliarneuronen innervate die gestreiften Muskelfasern auf der Iris und Linse, verantwortlich für die Pupillenkontraktion. Aderhautneuronen innervate den glatten Muskel der Aderhaut1,10,11,12.
Kulturen von Hühnerziliar Ganglien Neuronen haben sich als nützliche Werkzeuge für die Untersuchung von neuromuskulären Synapsen und Synapsenbildung1,5,9. Wenn man bedenkt, dass neuromuskuläre Synapsen cholinergesind 13, mit einer neuronalen Population, die cholinergen ist – CG-Neuronen – entstand als mögliche Alternative zu früheren Zellmodellen14. Diese Modelle bestanden in einer heterogenen neuronalen Population, in der nur ein kleiner Teil cholinergisch ist. Alternativ entwickeln sich Ziliarganglien-Neuronen relativ schnell invitro und bilden nach ca. 15 Stunden bereits Synapsen1. CG-Neuronen wurden im Laufe der Jahre als Modellsystem für verschiedene Forschungsstudien verwendet, aufgrund seiner relativ einfachen Isolation und Manipulation. Diese Anwendungen umfassen optogenetische Studien, Synapsenentwicklung, Apoptose und neuromuskuläre Wechselwirkungen14,15.
Wir beschreiben ein detailliertes Verfahren für die Zerlegung, Dissoziation und In-vitro-Kultur von Ziliarganglien-Neuronen aus embryonalen Tag 7 (E7) Kükenembryonen. Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um hochreine und stabile Zellkulturen von cholinergen Neuronen zu erhalten. Wir heben auch die wichtigsten Schritte des Protokolls hervor, die besondere Aufmerksamkeit erfordern und die Qualität der neuronalen Kulturen verbessern werden. Diese Kulturen können in vitro für mindestens 15 Tage aufrechterhalten werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll haben wir gezeigt, wie man CG-Neuronen vorbereitet und kultiviert. Die Identifizierung und Zerlegung des Ziliarganglien kann für unerfahrene Anwender schwierig sein. Daher präsentieren wir ein detailliertes und schrittweises Verfahren, um E7-Küken-Ziliarganglien effizient zu sezieren, das Gewebe zu dissoziieren und neuronale Kulturen vorzubereiten, die mindestens 15 Tage lang aufrechterhalten werden können. Die mit diesem Protokoll erhaltenen Ziliarganglienneuronen eignen sich auch für die Co-Kul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeiten wurden aus dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) im Rahmen des regionalen operationellen Programms Centro 2020 im Rahmen der Projekte CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, finanziert. CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, und über das COMPETE 2020 – Operationelles Programm für Wettbewerbsfähigkeit und Internationalisierung und portugiesische nationale Mittel über FCT – Fundaéo para a Ciéncia e a Tecnologia, I.P., im Rahmen der Projekte UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, und die Einzelzuschüsse SFRH/BD/141092/201 8 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) und von Marie Curie Actions – IRG, 7. Rahmenprogramm.
Materials
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
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