Summary

Isolation und Kultur von Chick Ciliary Ganglion Neurons

Published: August 08, 2020
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Summary

Küken-Ziliarganglien (CG) sind Teil des parasympathischen Nervensystems. Neuronale Kulturen von Küken CG Neuronen wurden gezeigt, dass effektive Zellmodelle in der Studie der Nervenmuskel-Interaktionen. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Zerlegung, Dissoziation und In-vitro-Kultur von CG-Neuronen aus Kükenembryonen.

Abstract

Küken Ziliarganglien (CG) sind Teil des parasympathischen Nervensystems und sind verantwortlich für die Innervation der Muskelgewebe im Auge vorhanden. Dieses Ganglion besteht aus einer homogenen Population von Ziliar- und Aderhautneuronen, die die muskelfasern inneren und glatten Muskelfasern bilden. Jeder dieser neuronalen Typen reguliert spezifische Augenstrukturen und Funktionen. Im Laufe der Jahre zeigten sich neuronale Kulturen der Küken-Ziliarganglien als wirksame Zellmodelle bei der Untersuchung von Muskel-Nerven-System-Wechselwirkungen, die durch cholinerge Synapsen kommunizieren. Ziliarganglien-Neuronen sind in ihrer Mehrheit cholinerge. Dieses Zellmodell hat sich als nützlich für bisher verwendete heterogene Zellmodelle erwiesen, die neben cholinergen verschiedene neuronale Typen umfassen. Anatomisch wird das Ziliarganglien zwischen dem Sehnerv (ON) und der Aderhautspalte (CF) lokalisiert. Hier beschreiben wir ein detailliertes Verfahren für die Zerlegung, Dissoziation und In-vitro-Kultur von Ziliarganglien-Neuronen aus Kükenembryonen. Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um hochreine und stabile Zellkulturen von CG-Neuronen zu erhalten, wobei die wichtigsten Schritte des Prozesses hervorgehoben werden. Diese Kulturen können 15 Tage lang in vitro gepflegt werden und zeigen damit die normale Entwicklung von CG-Kulturen. Die Ergebnisse zeigen auch, dass diese Neuronen mit Muskelfasern durch neuromuskuläre cholinerge Synapsen interagieren können.

Introduction

Ziliarganglion (CG) Neuronen gehören zum parasympathischen Nervensystem. Diese Neuronen sind cholinerg, in der Lage, muscarinische oder nikotinische Synapsen1,2,3. Anatomisch befindet sich die CG im hinteren Teil des Auges zwischen dem Sehnerv (ON) und der Aderhautspalte (CF) und besteht aus rund 6000 Neuronen in frühen embryonalen Stadien1,4. Für die erste Kulturwoche präsentieren Ziliarganglien-Neuronen eine multipolare Morphologie. Nach einer Woche beginnen sie, in einen unipolaren Zustand überzusteigen, wobei sich ein Neurit ausdehnt und das Axon5bildet. Darüber hinaus stirbt etwa die Hälfte der CG-Neuronen zwischen dem8. und14. Tag der Entwicklung von Kükenembryonen durch einen programmierten Prozess des Zelltodes. Dieser Rückgang der Anzahl der Neuronen führt zu einer Gesamtpopulation des Ziliarganglien von etwa 3000 Neuronen6,7,8. In vitro, Es gibt keine Verringerung der Anzahl der CG Neuronen, wenn mit Muskelzellen9 und CG Neuronen wachsen kann für mehrere Wochen kultiviert werden1,9.

Das Ziliarganglie besteht aus einer homogenen Population von Ziliarneuronen und Aderhautneuronen, die jeweils die Hälfte der neuronalen Population in der CG darstellen und den Muskel des Auges innervieren. Diese beiden Arten von Neuronen sind strukturell, anatomisch und funktionell unterschiedlich. Ziliarneuronen innervate die gestreiften Muskelfasern auf der Iris und Linse, verantwortlich für die Pupillenkontraktion. Aderhautneuronen innervate den glatten Muskel der Aderhaut1,10,11,12.

Kulturen von Hühnerziliar Ganglien Neuronen haben sich als nützliche Werkzeuge für die Untersuchung von neuromuskulären Synapsen und Synapsenbildung1,5,9. Wenn man bedenkt, dass neuromuskuläre Synapsen cholinergesind 13, mit einer neuronalen Population, die cholinergen ist – CG-Neuronen – entstand als mögliche Alternative zu früheren Zellmodellen14. Diese Modelle bestanden in einer heterogenen neuronalen Population, in der nur ein kleiner Teil cholinergisch ist. Alternativ entwickeln sich Ziliarganglien-Neuronen relativ schnell invitro und bilden nach ca. 15 Stunden bereits Synapsen1. CG-Neuronen wurden im Laufe der Jahre als Modellsystem für verschiedene Forschungsstudien verwendet, aufgrund seiner relativ einfachen Isolation und Manipulation. Diese Anwendungen umfassen optogenetische Studien, Synapsenentwicklung, Apoptose und neuromuskuläre Wechselwirkungen14,15.

Wir beschreiben ein detailliertes Verfahren für die Zerlegung, Dissoziation und In-vitro-Kultur von Ziliarganglien-Neuronen aus embryonalen Tag 7 (E7) Kükenembryonen. Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um hochreine und stabile Zellkulturen von cholinergen Neuronen zu erhalten. Wir heben auch die wichtigsten Schritte des Protokolls hervor, die besondere Aufmerksamkeit erfordern und die Qualität der neuronalen Kulturen verbessern werden. Diese Kulturen können in vitro für mindestens 15 Tage aufrechterhalten werden.

Protocol

1. Herstellung von Reagenzien HINWEIS: Die für dieses Verfahren notwendigen Materialien sind die folgenden: Zangen (Nr. 5 und Nr. 55), chirurgische Pinzette, Sezieren Petrischalen (schwarzer Boden), 24-Well-Platten, Kunststoff Pasteur Pipette, feuerpolierte Glas Pasteur Pipette, 10 ml Spritze, 0,22 m Spritze Filter. Bereiten und sterilisieren Sie alle Materialien, die für das Protokoll benötigt werden, einschließlich Glasabdeckungen, Zangen (Nr. 5 und Nr. 55), …

Representative Results

Die geschätzte Dauer dieses Verfahrens hängt stark von der Ausbeute ab, die für jedes spezifische Experiment benötigt wird, und damit von der Anzahl der Ziliarganglien, die isoliert werden müssen. Bei einem geschätzten Ertrag von 1 x 106 Zellen/ml isolieren Sie etwa 70 Ziliarganglien (35 Eier). Für diese Anzahl von Ganglien, dauert es 2-3 Stunden für die Sezierverfahren und insgesamt 4-5 Stunden für das gesamte Verfahren. Eine schritt für Schritt Darstellung des Isolationsprotokolls ist <strong class…

Discussion

In diesem Protokoll haben wir gezeigt, wie man CG-Neuronen vorbereitet und kultiviert. Die Identifizierung und Zerlegung des Ziliarganglien kann für unerfahrene Anwender schwierig sein. Daher präsentieren wir ein detailliertes und schrittweises Verfahren, um E7-Küken-Ziliarganglien effizient zu sezieren, das Gewebe zu dissoziieren und neuronale Kulturen vorzubereiten, die mindestens 15 Tage lang aufrechterhalten werden können. Die mit diesem Protokoll erhaltenen Ziliarganglienneuronen eignen sich auch für die Co-Kul…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeiten wurden aus dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) im Rahmen des regionalen operationellen Programms Centro 2020 im Rahmen der Projekte CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, finanziert. CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, und über das COMPETE 2020 – Operationelles Programm für Wettbewerbsfähigkeit und Internationalisierung und portugiesische nationale Mittel über FCT – Fundaéo para a Ciéncia e a Tecnologia, I.P., im Rahmen der Projekte UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, und die Einzelzuschüsse SFRH/BD/141092/201 8 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) und von Marie Curie Actions – IRG, 7. Rahmenprogramm.

Materials

5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) Merck (Sigma Aldrich) F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody Thermo Fisher Scientific A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A21235
B27 supplement (50x), serum free Invitrogen (Gibco) 17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M Merck (Sigma Aldrich) AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate VWR 24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil Invitrogen (Gibco) 10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology Fisher Scientific 10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin Invitrogen (Gibco) 26050-070
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen (Gibco) 25030-081
Mouse laminin I Cultrex (R&D systems) 3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin Merck (Sigma Aldrich) T8578
Mouse monoclonal SV2 DSHB AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) Thermo Fisher Scientific 11874235
Neurobasal medium without glutamine Invitrogen (Gibco) 21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) Invitrogen (Gibco) 15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture Merck (Sigma Aldrich) P3532
Poly-D-Lysine Merck (Sigma Aldrich) P7886
Potassium chloride Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) 31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS Panreac Applichem 131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI Invitrogen (Gibco) P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk Fisher Scientific 10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) Peprotech 450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO Panreac Applichem 131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade Panreac Applichem 141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x) Thermo Fisher 11360039
Syringe without needle, 10 mL Thermo Fisher 11587292
Trypsin 1:250 powder Invitrogen (Gibco) 27250-018

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Cite This Article
Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. O., Pedro, J. R., Almeida, R. D. Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61431, doi:10.3791/61431 (2020).

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