Summary

チラリア性神経節ニューロンの分離と培養

Published: August 08, 2020
doi:

Summary

ひよこ毛様体神経節(CG)は副交感神経系の一部である。ひよこCGニューロンの神経細胞培養は、神経筋相互作用の研究において有効な細胞モデルであることが示された。我々は、ひよこ胚からのCGニューロンの解剖、解離およびインビトロ培養のための詳細なプロトコルを記述する。

Abstract

ひよこ毛様体神経節(CG)は副交感神経系の一部であり、眼に存在する筋肉組織の神経の活性化を担当する。この神経節は、それぞれ、内臓が線状筋線維と平滑筋線維を線状にした毛様体及び脈絡膜ニューロンの均質集団によって構成される。これらの神経細胞タイプのそれぞれは、特定の眼の構造と機能を調節します。長年にわたり、ひよこ毛様体神経節の神経細胞培養は、コリン作動性シナプスを介して通信する筋肉神経系相互作用の研究において有効な細胞モデルであることが示された。毛様神経節ニューロンは、その大部分で、コリン作動性である。この細胞モデルは、コリン作動性以外にも、いくつかの神経細胞型を含む、以前に使用されていた異種細胞モデルに比較的有用であることが示されている。解剖学的に、毛様体神経節は視神経(ON)と脈絡膜裂動(CF)の間に局在する。ここでは、ひよこ胚由来の毛様神経節ニューロンの解剖、解離および体外培養の詳細な手順を説明する。CGニューロンの非常に純粋で安定した細胞培養を得るためにステップバイステップのプロトコルを提供し、プロセスの重要なステップを強調しています。これらの培養は15日間インビトロで維持することができ、この結果、CG培養の正常な発展を示す。結果はまた、これらのニューロンが神経筋コリン作動性シナプスを介して筋線維と相互作用できることを示す。

Introduction

毛様神経節(CG)ニューロンは副交感神経系に属する。これらのニューロンはコリン作動性であり、ムスカリン性またはニコチン性シナプス11、2、32,3を確立することができる。解剖学的には、CGは視神経(ON)と脈絡膜裂け(CF)との間の眼の後部に位置し、初期胚期11、44の約6000ニューロンからなる。培養の最初の1週間、毛様神経節ニューロンは多極形態を提示する。1週間後、彼らは単極状態に移行し始め、1つの神経突起が延長され、軸索5を形成する。さらに、CGニューロンの約半数は、細胞死のプログラムプロセスを通じて、ひよこ胚の発達の8日目から14日目の間に死ぬ。ニューロン数の減少は,、約3000ニューロン6、7、87の毛様体の総集団をもたらす。68インビトロでは、筋細胞9およびCGニューロンで増殖した場合のCGニューロンの数の減少がなく、数週間1、99のために培養することができる。1

毛様性神経節は、毛様体ニューロンと脈絡膜ニューロンの均質な集団で構成され、それぞれがCGのニューロン集団の半分を表し、眼の筋肉を内在化する。これらの2種類のニューロンは、構造上、解剖学的、機能的に異なっている。毛様体ニューロンは虹彩とレンズ上の線条性筋線維を内側に吐き出し、瞳孔収縮を担当する。脈絡膜ニューロンは、脈絡膜1、10、11、1210,11の平滑筋を内側れ、1

鶏毛様神経節ニューロンの培養は、神経筋シナプスおよびシナプス形成11、5、95,9の研究に有用なツールであることが示されている。神経筋シナプスがコリン作動性13であることを考えると、コリン作動性である神経集団を用いて – CGニューロン – 以前の細胞モデル14に代わる潜在的な代替として浮上した。これらのモデルは異種神経集団で構成され、ほんの一部だけがコリン作動性である。あるいは、毛様性神経節ニューロンは、インビトロで比較的速く発達し、約15時間後にすでにシナプス1を形成している。CGニューロンは、比較的容易な分離と操作のために、明確な研究のために長年にわたってモデルシステムとして使用されてきました。これらのアプリケーションには、光遺伝学的研究、シナプスの発達、アポトーシスおよび神経筋相互作用14,15,15が含まれる。

我々は、胚性7日目(E7)のひよこ胚からの毛様神経節ニューロンの解剖、解離およびインビトロ培養のための詳細な手順を説明する。我々は、コリン作動性ニューロンの非常に純粋で安定した細胞培養を得るために、ステップバイステップのプロトコルを提供する。我々はまた、特別な注意を必要とし、神経培養の質を向上させるプロトコルの重要なステップを強調する。これらの培養物は、少なくとも15日間インビトロで維持することができる。

Protocol

1. 試薬の調製 注:この手順に必要な材料は次のとおりです:鉗子(nº 5およびnº 55)、外科ピンセット、解剖ペトリ皿(黒底)、24ウェルプレート、プラスチックパスツールピペット、火磨ガラスパスツールピペット、10 mLシリンジ、0.22 μmシリンジフィルター。 ガラスカバーリップ、鉗子(nº 5およびnº 55)、外科ピンセット、ペトリ皿(黒底)、蒸留されたH…

Representative Results

この手順の推定持続時間は、特定の実験ごとに必要な収量、したがって、分離する必要がある毛様体核節の数に依存します。推定収量が1 x 106細胞/mLの場合、約70個の毛様様神経節(35個の卵)を単離する。この神経節の数については、解剖手順には2〜3時間、総処置には合計4〜5時間かかります。分離プロトコルの手順を示します図1Aを参照してください。毛様体の?…

Discussion

このプロトコルでは、CGニューロンの調製と培養の方法を示した。毛様体の同定と解剖は、経験の浅いユーザーにとって困難な場合があります。そこで、E7のひよこ毛様体神経節を効率的に解剖し、組織を解離し、少なくとも15日間維持できる神経細胞培養を調製するための詳細かつ段階的な手順を提示する。このプロトコルで得られた毛様神経節ニューロンは、筋肉細胞との共培養にも適し?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020、CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGEの下でCentro 2020地域運用プログラムを通じて、欧州地域開発基金(ERDF)によって資金提供されました。 CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS、およびCOMPETE 2020を通じて – FCTを介して競争力と国際化のための運用プログラムとポルトガルの国民資金 – フンダサン・パラ・ア・シエンシア・エ・ア・テクノロジア、I.P.、プロジェクトUIDB/04539/2020、 UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, 個人助成金 SFRH/BD/141092/20 18 (M.D.)、DL57/2016/CP1448/CT0009(R.O.C.)、SFRH/BD/2011(J.R.P.)、マリー・キュリー・アクションズ – IRG、第7回フレームワーク・プログラム。

Materials

5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) Merck (Sigma Aldrich) F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody Thermo Fisher Scientific A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A21235
B27 supplement (50x), serum free Invitrogen (Gibco) 17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M Merck (Sigma Aldrich) AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate VWR 24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil Invitrogen (Gibco) 10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology Fisher Scientific 10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin Invitrogen (Gibco) 26050-070
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen (Gibco) 25030-081
Mouse laminin I Cultrex (R&D systems) 3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin Merck (Sigma Aldrich) T8578
Mouse monoclonal SV2 DSHB AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) Thermo Fisher Scientific 11874235
Neurobasal medium without glutamine Invitrogen (Gibco) 21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) Invitrogen (Gibco) 15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture Merck (Sigma Aldrich) P3532
Poly-D-Lysine Merck (Sigma Aldrich) P7886
Potassium chloride Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) 31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS Panreac Applichem 131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI Invitrogen (Gibco) P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk Fisher Scientific 10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) Peprotech 450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO Panreac Applichem 131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade Panreac Applichem 141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x) Thermo Fisher 11360039
Syringe without needle, 10 mL Thermo Fisher 11587292
Trypsin 1:250 powder Invitrogen (Gibco) 27250-018

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Cite This Article
Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. O., Pedro, J. R., Almeida, R. D. Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61431, doi:10.3791/61431 (2020).

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