Summary

Изоляция и культура Чик Ciliary Ganglion нейронов

Published: August 08, 2020
doi:

Summary

Чик цилиарной ганглии (CG) являются частью парасимпатической нервной системы. Нейронные культуры цыпленка CG нейронов было показано, что эффективные модели клеток в изучении взаимодействия мышц нерва. Мы описываем подробный протокол для вскрытия, диссоциации и культуры in vitro нейронов CG от эмбрионов птенцов.

Abstract

Чик цилиарной ганглии (CG) являются частью парасимпатической нервной системы и отвечают за иннервацию мышечных тканей, присутствующих в глазу. Этот ганглия состоит из однородной популяции цилиарных и хороидальных нейронов, которые иннервировать полосатые и гладкие мышечные волокна, соответственно. Каждый из этих нейронных типов регулирует определенные структуры глаз и функции. На протяжении многих лет, нейронные культуры цыпленка цилиарных ганглиев было показано, чтобы быть эффективными моделями клеток в изучении мышечно-нервной системы взаимодействий, которые общаются через холинергические синапсы. Ciliary ганглия нейроны, в большинстве, холинергические. Эта модель клеток была показана, чтобы быть полезным сравнительно ранее использовались неоднородные модели клеток, которые состоят из нескольких типов нейронов, кроме холинергических. Анатомически, цилиарный ганглия локализована между зрительным нервом (ON) и трещиной хороида (CF). Здесь мы описываем подробную процедуру вскрытия, диссоциации и культуры in vitro цилиарных ганглиев нейронов из эмбрионов птенцов. Мы предоставляем пошаговый протокол для получения высоко чистых и стабильных клеточных культур нейронов CG, подчеркивая ключевые этапы процесса. Эти культуры могут поддерживаться в пробирке в течение 15 дней, и, таким образом, мы показываем нормальное развитие cg культур. Результаты также показывают, что эти нейроны могут взаимодействовать с мышечными волокнами через нейро-мышечные холинергические синапсы.

Introduction

Цилиаровые ганглия (CG) нейроны принадлежат к парасимпатической нервной системы. Эти нейроны холинергические, будучи в состоянии установить muscarinic или никотиновых синапсов1,2,3. Анатомически, CG расположен в задней части глаза между зрительным нервом (ON) и трещины сосудистой системы (CF) и состоит из около 6000 нейронов в ранних эмбриональных стадиях1,4. В течение первой недели в культуре, цилиарные ганглия нейроны представляют многополярную морфологию. Через неделю они начинают переходить в однополярное состояние, при этом один неврит расширяется и образует аксон5. Кроме того, примерно половина нейронов CG умирают между8-м и 14-м днем развития эмбриона цыпленка, через запрограммированный процесс клеточной смерти.th Это снижение числа нейронов приводит к общей популяции цилиарного ганглия около 3000 нейронов6,7,8. В пробирке, нет сокращения числа нейронов CG, когда выросли с мышечными клетками9 и CG нейроны могут быть культивируется в течение нескольких недель1,9.

Цилиарный ганглия состоит из однородной популяции цилиарных нейронов и хороидальных нейронов, каждый из которых представляет половину популяции нейронов в CG, иннервируя мышцы глаза. Эти два типа нейронов структурно, анатомически и функционально отличаются. Ciliary нейроны innervate полосатые мышечные волокна на радужной оболочке глаза и хрусталика, будучи ответственным за сокращение зрачка. Хороидальные нейроны иннервировать гладкую мышцу сосудистой1,10,11,12.

Культуры куриных цилиарных ганглия нейронов было показано, что полезные инструменты для изучения нервно-мышечных синапсов и формирования синапса1,5,9. Учитывая, что нервно-мышечные синапсы являются холинергические13, используя нейронной популяции, которая холинергический – CG нейронов – возникла в качестве потенциальной альтернативы предыдущим моделям клеток14. Эти модели состояли из неоднородной нейронной популяции, в которой лишь небольшая часть является холинергической. Кроме того, цилиарные ганглия нейроны развиваются относительно быстро in vitro, и примерно через 15 часов уже образуют синапсы1. CG нейроны были использованы в качестве модели системы на протяжении многих лет для различных исследований, из-за его относительно легкости изоляции и манипуляции. Эти приложения включают в себя оптогенетические исследования, развитие синапса, апоптоз и нервно-мышечные взаимодействия14,,15.

Мы описываем подробную процедуру вскрытия, диссоциации и культуры in vitro цилиарных ганглиев нейронов из эмбриональных эмбрионов 7 дня (Е7). Мы предоставляем пошаговый протокол для получения высоко чистых и стабильных клеточных культур холинергических нейронов. Мы также выделяем ключевые шаги протокола, которые требуют особого внимания и которые улучшат качество нейронных культур. Эти культуры могут поддерживаться в пробирке, по крайней мере 15 дней.

Protocol

1. Подготовка реагентов ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, необходимые для этой процедуры являются следующие: щипцы (no 5 и Noo 55), хирургические пинцет, рассечение Петри блюда (черное дно), 24-хорошо пластины, пластиковые пастерская пипетки, огонь полированного стекла Пастер пип?…

Representative Results

Расчетная продолжительность этой процедуры в строгом времени зависит от урожайности, необходимой для каждого конкретного эксперимента, и, таким образом, от количества цилиарных ганглиев, которые необходимо изолировать. Для предполагаемого выхода 1 х 106 клеток/мЛ, изолировать око…

Discussion

В этом протоколе мы продемонстрировали, как подготовить и культуры CG нейронов. Идентификация и вскрытие цилиарского ганглия может быть затруднено для неопытных пользователей. Поэтому мы представляем детальную и пошаговую процедуру, чтобы эффективно вскрыть е7 цыпленка цилиарной ганг…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась Европейским фондом регионального развития (ERDF) в рамках Региональной оперативной программы Centro 2020 в рамках проектов CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO20 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, и через COMPETE 2020 – Оперативная программа по конкурентоспособности и интернационализации и португальских национальных фондов через FCT – Фонд пара Ci’ncia электронной Текнологии, I.P., в рамках проектов UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, а также индивидуальные гранты SFRH/BD/141092/101092/104100/2008, а также индивидуальные гранты SFRH/BD/141092/1 2018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) и Мари Кюри Действия – IRG, 7-я Рамочная программа.

Materials

5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) Merck (Sigma Aldrich) F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody Thermo Fisher Scientific A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A21235
B27 supplement (50x), serum free Invitrogen (Gibco) 17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M Merck (Sigma Aldrich) AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate VWR 24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil Invitrogen (Gibco) 10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology Fisher Scientific 10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin Invitrogen (Gibco) 26050-070
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen (Gibco) 25030-081
Mouse laminin I Cultrex (R&D systems) 3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin Merck (Sigma Aldrich) T8578
Mouse monoclonal SV2 DSHB AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) Thermo Fisher Scientific 11874235
Neurobasal medium without glutamine Invitrogen (Gibco) 21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) Invitrogen (Gibco) 15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture Merck (Sigma Aldrich) P3532
Poly-D-Lysine Merck (Sigma Aldrich) P7886
Potassium chloride Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) 31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS Panreac Applichem 131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI Invitrogen (Gibco) P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk Fisher Scientific 10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) Peprotech 450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO Panreac Applichem 131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade Panreac Applichem 141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x) Thermo Fisher 11360039
Syringe without needle, 10 mL Thermo Fisher 11587292
Trypsin 1:250 powder Invitrogen (Gibco) 27250-018

References

  1. Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
  2. Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Developmental Biology. 28, 407-429 (1972).
  3. Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
  4. Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
  5. Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
  6. Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
  7. Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
  8. Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
  9. Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
  10. Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
  11. Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
  12. Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
  13. Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
  14. Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
  15. Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
  16. Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
  17. Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
  18. Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
  19. Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
  20. Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
  21. Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
  22. Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
  23. Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
  24. Squire, L. R. . Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
  25. Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
  26. Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
  27. Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).

Play Video

Cite This Article
Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. O., Pedro, J. R., Almeida, R. D. Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61431, doi:10.3791/61431 (2020).

View Video