Изоляция и культура Чик Ciliary Ganglion нейронов
Summary
Чик цилиарной ганглии (CG) являются частью парасимпатической нервной системы. Нейронные культуры цыпленка CG нейронов было показано, что эффективные модели клеток в изучении взаимодействия мышц нерва. Мы описываем подробный протокол для вскрытия, диссоциации и культуры in vitro нейронов CG от эмбрионов птенцов.
Abstract
Чик цилиарной ганглии (CG) являются частью парасимпатической нервной системы и отвечают за иннервацию мышечных тканей, присутствующих в глазу. Этот ганглия состоит из однородной популяции цилиарных и хороидальных нейронов, которые иннервировать полосатые и гладкие мышечные волокна, соответственно. Каждый из этих нейронных типов регулирует определенные структуры глаз и функции. На протяжении многих лет, нейронные культуры цыпленка цилиарных ганглиев было показано, чтобы быть эффективными моделями клеток в изучении мышечно-нервной системы взаимодействий, которые общаются через холинергические синапсы. Ciliary ганглия нейроны, в большинстве, холинергические. Эта модель клеток была показана, чтобы быть полезным сравнительно ранее использовались неоднородные модели клеток, которые состоят из нескольких типов нейронов, кроме холинергических. Анатомически, цилиарный ганглия локализована между зрительным нервом (ON) и трещиной хороида (CF). Здесь мы описываем подробную процедуру вскрытия, диссоциации и культуры in vitro цилиарных ганглиев нейронов из эмбрионов птенцов. Мы предоставляем пошаговый протокол для получения высоко чистых и стабильных клеточных культур нейронов CG, подчеркивая ключевые этапы процесса. Эти культуры могут поддерживаться в пробирке в течение 15 дней, и, таким образом, мы показываем нормальное развитие cg культур. Результаты также показывают, что эти нейроны могут взаимодействовать с мышечными волокнами через нейро-мышечные холинергические синапсы.
Introduction
Цилиаровые ганглия (CG) нейроны принадлежат к парасимпатической нервной системы. Эти нейроны холинергические, будучи в состоянии установить muscarinic или никотиновых синапсов1,2,3. Анатомически, CG расположен в задней части глаза между зрительным нервом (ON) и трещины сосудистой системы (CF) и состоит из около 6000 нейронов в ранних эмбриональных стадиях1,4. В течение первой недели в культуре, цилиарные ганглия нейроны представляют многополярную морфологию. Через неделю они начинают переходить в однополярное состояние, при этом один неврит расширяется и образует аксон5. Кроме того, примерно половина нейронов CG умирают между8-м и 14-м днем развития эмбриона цыпленка, через запрограммированный процесс клеточной смерти.th Это снижение числа нейронов приводит к общей популяции цилиарного ганглия около 3000 нейронов6,7,8. В пробирке, нет сокращения числа нейронов CG, когда выросли с мышечными клетками9 и CG нейроны могут быть культивируется в течение нескольких недель1,9.
Цилиарный ганглия состоит из однородной популяции цилиарных нейронов и хороидальных нейронов, каждый из которых представляет половину популяции нейронов в CG, иннервируя мышцы глаза. Эти два типа нейронов структурно, анатомически и функционально отличаются. Ciliary нейроны innervate полосатые мышечные волокна на радужной оболочке глаза и хрусталика, будучи ответственным за сокращение зрачка. Хороидальные нейроны иннервировать гладкую мышцу сосудистой1,10,11,12.
Культуры куриных цилиарных ганглия нейронов было показано, что полезные инструменты для изучения нервно-мышечных синапсов и формирования синапса1,5,9. Учитывая, что нервно-мышечные синапсы являются холинергические13, используя нейронной популяции, которая холинергический – CG нейронов – возникла в качестве потенциальной альтернативы предыдущим моделям клеток14. Эти модели состояли из неоднородной нейронной популяции, в которой лишь небольшая часть является холинергической. Кроме того, цилиарные ганглия нейроны развиваются относительно быстро in vitro, и примерно через 15 часов уже образуют синапсы1. CG нейроны были использованы в качестве модели системы на протяжении многих лет для различных исследований, из-за его относительно легкости изоляции и манипуляции. Эти приложения включают в себя оптогенетические исследования, развитие синапса, апоптоз и нервно-мышечные взаимодействия14,,15.
Мы описываем подробную процедуру вскрытия, диссоциации и культуры in vitro цилиарных ганглиев нейронов из эмбриональных эмбрионов 7 дня (Е7). Мы предоставляем пошаговый протокол для получения высоко чистых и стабильных клеточных культур холинергических нейронов. Мы также выделяем ключевые шаги протокола, которые требуют особого внимания и которые улучшат качество нейронных культур. Эти культуры могут поддерживаться в пробирке, по крайней мере 15 дней.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы продемонстрировали, как подготовить и культуры CG нейронов. Идентификация и вскрытие цилиарского ганглия может быть затруднено для неопытных пользователей. Поэтому мы представляем детальную и пошаговую процедуру, чтобы эффективно вскрыть е7 цыпленка цилиарной ганг…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Европейским фондом регионального развития (ERDF) в рамках Региональной оперативной программы Centro 2020 в рамках проектов CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO20 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, и через COMPETE 2020 – Оперативная программа по конкурентоспособности и интернационализации и португальских национальных фондов через FCT – Фонд пара Ci’ncia электронной Текнологии, I.P., в рамках проектов UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, а также индивидуальные гранты SFRH/BD/141092/101092/104100/2008, а также индивидуальные гранты SFRH/BD/141092/1 2018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) и Мари Кюри Действия – IRG, 7-я Рамочная программа.
Materials
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
References
- Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
- Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Developmental Biology. 28, 407-429 (1972).
- Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
- Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
- Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
- Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
- Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
- Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
- Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
- Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
- Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
- Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
- Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
- Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
- Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
- Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
- Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
- Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
- Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
- Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
- Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
- Squire, L. R. . Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
- Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
- Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
- Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).
