Isolamento e cultura dei neuroni del Ganglione Ciliario
Summary
I gangli ciliari (CG) fanno parte del sistema nervoso parasimpatico. Le colture neuronali dei neuroni CG del pulcino hanno dimostrato di essere modelli cellulari efficaci nello studio delle interazioni nervose del nervo. Descriviamo un protocollo dettagliato per la dissezione, la dissociazione e la cultura in vitro dei neuroni CG da embrioni di pulcino.
Abstract
I gangli ciliari (CG) fanno parte del sistema nervoso parasimpatico e sono responsabili dell’innervazione dei tessuti muscolari presenti nell’occhio. Questo ganglio è costituito da una popolazione omogenea di neuroni ciliari e conoidi che innervare fibre muscolari striate e lisce, rispettivamente. Ognuno di questi tipi neuronali regolano specifiche strutture e funzioni oculari. Nel corso degli anni, le colture neuronali dei gangli ai pulcini hanno dimostrato di essere efficaci modelli cellulari nello studio delle interazioni muscolo-nervosa del sistema, che comunicano attraverso le sinapsi colinergiche. I neuroni gangliari ciliari sono, nella sua maggioranza, colinergici. Questo modello cellulare ha dimostrato di essere utile in modo comparativo a modelli cellulari eterogenei usati in precedenza che comprendono diversi tipi neuronali, oltre al colinergico. Anatomicamente, il ganglio ciliare è localizzato tra il nervo ottico (ON) e la fessura corale (CF). Qui, descriviamo una procedura dettagliata per la dissezione, la dissociazione e la coltura in vitro dei neuroni gangliari ciliari da embrioni di pulcino. Forniamo un protocollo passo-passo al fine di ottenere colture cellulari altamente pure e stabili di neuroni CG, evidenziando le fasi chiave del processo. Queste culture possono essere mantenute in vitro per 15 giorni e, con la presente, mostriamo il normale sviluppo delle culture CG. I risultati mostrano anche che questi neuroni possono interagire con le fibre muscolari attraverso sinapsi colinergiche neuro-muscolari.
Introduction
I neuroni gangliari cigliari (CG) appartengono al sistema nervoso parasimpatico. Questi neuroni sono colinergici, essendo in grado di stabilire sinapsi muscariche o nicotiniche1,2,3. Anatomicamente, il CG si trova nella parte posteriore dell’occhio tra il nervo ottico (ON) e la fessura contoide (CF) e consiste di circa 6000 neuroni nei primi stadi embrionali1,4. Per la prima settimana di cultura, i neuroni gangliari ciliari presentano una morfologia multipolare. Dopo una settimana, iniziano a passare a uno stato unipolare, con un neurite che estende e forma l’assone5. Inoltre, circa la metà dei neuroni CG muore tra l’8e il 14esimo giorno di sviluppo dell’embrione del pulcino, attraverso un processo programmato di morte cellulare. Questa diminuzione del numero di neuroni si traduce in una popolazione totale del ganglio ciliare di circa 3000 neuroni6,7,8. In vitro, non c’è nessuna riduzione del numero di neuroni CG quando coltivato con le cellule muscolari9 e neuroni CG possono essere coltivati per diverse settimane1,9.
Il ganglio ciliario è costituito da una popolazione omogenea di neuroni ciliari e neuroni conoidi, ognuno dei quali rappresenta la metà della popolazione neuronale nel CG, innervando il muscolo dell’occhio. Questi due tipi di neuroni sono strutturalmente, anatomicamente e funzionalmente distinti. I neuroni ciliari innervano le fibre muscolari striate sull’iride e sulla lente, essendo responsabili della contrazione della pupilla. I neuroni chioidali innervano il muscolo liscio della contoide1,10,11,12.
Le colture di neuroni gangliari ciliari di pollo hanno dimostrato di essere strumenti utili per lo studio delle sinapsi neuromuscolari e della formazione di sinapsi1,5,9. Considerando che le sinapsi neuromuscolari sono colinergiche13, utilizzando una popolazione neuronale che è colinergico – neuroni CG – emerso come una potenziale alternativa ai modelli cellulari precedenti14. Questi modelli consistevano in una popolazione neuronale eterogenea, in cui solo una piccola parte è colinergica. In alternativa, i neuroni gangliari ciliari si sviluppano relativamente veloce in vitro, e dopo circa 15 ore già formano sinapsi1. I neuroni CG sono stati utilizzati come sistema modello nel corso degli anni per studi di ricerca distinti, a causa della sua relativamente facilità di isolamento e manipolazione. Queste applicazioni includono studi optogenetici, sviluppo di sinapsi, apoptosi e interazioni neuromuscolari14,15.
Descriviamo una procedura dettagliata per la dissezione, la dissociazione e la coltura in vitro dei neuroni gangli ciliari provenienti dagli embrioni embrionali 7 (E7). Forniamo un protocollo passo-passo al fine di ottenere colture cellulari altamente pure e stabili di neuroni colinergici. Mettiamo inoltre in evidenza i passaggi chiave del protocollo che richiedono particolare attenzione e che miglioreranno la qualità delle colture neuronali. Queste culture possono essere mantenute in vitro per almeno 15 giorni.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, abbiamo dimostrato come preparare e cultura neuroni CG. L’identificazione e la dissezione del ganglio ciliario può essere difficile per gli utenti inesperti. Pertanto, presentiamo una procedura dettagliata e graduale per sezionare in modo efficiente i gangli ciliari dei pulcini E7, dissociare il tessuto e preparare colture neuronali che possono essere mantenute per almeno 15 giorni. I neuroni gangliari ciliari ottenuti con questo protocollo sono adatti anche per la co-coltura con le cellule muscola…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal Fondo europeo di sviluppo regionale (ERDF), attraverso il Programma Operativo Regionale Centro 2020 nell’ambito di progetti CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, e attraverso il COMPETE 2020 – Programma Operativo per la Competitività e l’Internazionalizzazione e i fondi nazionali portoghesi tramite FCT – Fundao para a Ciància e a a, Tecnologia, I.P., nell’ambito dei progetti UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008 e le singole sovvenzioni SFRH/BD/141092/201 8 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) e da Marie Curie Actions – IRG, 7o Programma Quadro.
Materials
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
References
- Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
- Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Developmental Biology. 28, 407-429 (1972).
- Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
- Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
- Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
- Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
- Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
- Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
- Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
- Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
- Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
- Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
- Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
- Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
- Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
- Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
- Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
- Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
- Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
- Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
- Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
- Squire, L. R. . Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
- Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
- Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
- Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).
