Summary

Isolement et culture des neurones ganglionnaires de Chick

Published: August 08, 2020
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Summary

Les ganglions ciliaires de poussin (CG) font partie du système nerveux parasympathique. Les cultures neuronales des neurones de CG de poussin ont été montrées pour être des modèles de cellules efficaces dans l’étude des interactions de muscle nerveux. Nous décrivons un protocole détaillé pour la dissection, la dissociation et la culture in vitro des neurones de CG des embryons de poussin.

Abstract

Les ganglions ciliaires de poussin (CG) font partie du système nerveux parasympathique et sont responsables de l’innervation des tissus musculaires présents dans l’oeil. Ce ganglion est constitué par une population homogène de neurones ciliaires et choroïdes qui innervate les fibres musculaires striées et lisses, respectivement. Chacun de ces types neuronaux régule des structures et des fonctions oculaires spécifiques. Au fil des ans, les cultures neuronales des ganglions ciliaires poussins se sont avérées être des modèles cellulaires efficaces dans l’étude des interactions muscle-nerveux du système, qui communiquent par synapses cholinergiques. Les neurones de ganglion ciliaire sont, dans sa majorité, cholinergiques. Ce modèle cellulaire s’est avéré utile comparativement aux modèles de cellules hétérogènes précédemment utilisés qui comprennent plusieurs types neuronaux, outre cholinergique. Anatomiquement, le ganglion ciliaire est localisé entre le nerf optique (ON) et la fissure choroïde (CF). Ici, nous décrivons une procédure détaillée pour la dissection, la dissociation et la culture in vitro des neurones ganglionnaires ciliaires des embryons de poussin. Nous fournissons un protocole étape par étape afin d’obtenir des cultures cellulaires très pures et stables de neurones CG, mettant en évidence les étapes clés du processus. Ces cultures peuvent être maintenues in vitro pendant 15 jours et, par la présente, nous montrons le développement normal des cultures cg. Les résultats montrent également que ces neurones peuvent interagir avec les fibres musculaires par le biais de synapses cholinergiques neuro-musculaires.

Introduction

Les neurones du ganglion ciliaire (CG) appartiennent au système nerveux parasympathique. Ces neurones sont cholinergiques, étant en mesure d’établir des synapses muscariniques ou nicotiniques1,2,3. Anatomiquement, le CG est situé dans la partie postérieure de l’œil entre le nerf optique (ON) et la fissure choroïde (CF) et se compose d’environ 6000 neurones dans les premiers stades embryonnaires1,4. Pour la première semaine en culture, les neurones ganglionnaires ciliaires présentent une morphologie multipolaire. Après une semaine, ils commencent à la transition vers un état unipolaire, avec une neurite s’étendant et formant l’axon5. En outre, environ la moitié des neurones cg meurent entre le8 e et le14ème jour du développement de l’embryon de poussin, par un processus programmé de la mort cellulaire. Cette diminution du nombre de neurones se traduit par une population totale du ganglion ciliaire d’environ 3000 neurones6,7,8. In vitro, il n’y a pas de réduction du nombre de neurones CG lorsqu’ils sont cultivés avec les cellules musculaires9 et les neurones CG peuvent être cultivés pendant plusieurs semaines1,9.

Le ganglion ciliaire se compose d’une population homogène de neurones ciliaires et de neurones choroïdes, représentant chacun la moitié de la population neuronale dans le CG, instériorisant le muscle de l’œil. Ces deux types de neurones sont structurellement, anatomiquement et fonctionnellement distincts. Les neurones ciliaires innervotent les fibres musculaires striées sur l’iris et la lentille, étant responsables de la contraction de la pupille. Les neurones choroïdes innervate le muscle lisse de la choroïde1,10,11,12.

Les cultures des neurones ganglionnaires ciliaires de poulet se sont avérées des outils utiles pour l’étude des synapses neuromusculaires et de la formation de synapse1,5,9. Considérant que les synapses neuromusculaires sont cholinergiques13, en utilisant une population neuronale qui est cholinergique – neurones CG – émergé comme une alternative potentielle aux modèles cellulaires précédents14. Ces modèles se composaient d’une population neuronale hétérogène, dans laquelle seule une petite partie est cholinergique. Alternativement, les neurones de ganglion ciliaire se développent relativement rapidement invitro, et après environ 15 heures forment déjà des synapses1. Les neurones cg ont été utilisés comme système modèle au fil des ans pour des études de recherche distinctes, en raison de sa facilité relative d’isolement et de manipulation. Ces applications comprennent les études optogénétiques, le développement de la synapse, l’apoptose et les interactions neuromusculaires14,15.

Nous décrivons une procédure détaillée pour la dissection, la dissociation et la culture in vitro des neurones ganglionnaires ciliaires des embryons de poussins du jour embryonnaire 7 (E7). Nous fournissons un protocole étape par étape afin d’obtenir des cultures cellulaires très pures et stables de neurones cholinergiques. Nous soulignons également les étapes clés du protocole qui nécessitent une attention particulière et qui amélioreront la qualité des cultures neuronales. Ces cultures peuvent être maintenues in vitro pendant au moins 15 jours.

Protocol

1. Préparation des réactifs REMARQUE : Les matériaux nécessaires à cette intervention sont les suivants : forceps (nº 5 et nº 55), pinces à épiler chirurgicales, dissection petri (fond noir), plaques de 24 puits, pipette Pasteur en plastique, pipette Pasteur en verre poli par le feu, seringue de 10 mL, filtre à seringues 0,22 μm. Préparer et stériliser tout le matériel nécessaire au protocole, y compris les couvercles en verre, les forceps (nº 5 et …

Representative Results

La durée estimée de cette procédure dépend étroitement du rendement nécessaire pour chaque expérience spécifique et, par conséquent, du nombre de ganglions ciliaires qui doivent être isolés. Pour un rendement estimé de 1 x 106 cellules/mL, isoler environ 70 ganglions ciliaires (35 œufs). Pour ce nombre de ganglions, il faudra 2-3 heures pour la procédure de dissection et un total de 4-5 heures pour la procédure totale. Une illustration étape par étape du protocole d’isolement est présentée…

Discussion

Dans ce protocole, nous avons démontré comment préparer et culturer les neurones CG. L’identification et la dissection du ganglion ciliaire peuvent être difficiles pour les utilisateurs non exexpérienced. Par conséquent, nous présentons une procédure détaillée et étape par étape pour disséquer efficacement E7 ganglions ciliaires poussin, dissocier le tissu et préparer des cultures neuronales qui peuvent être maintenues pendant au moins 15 jours. Les neurones ganglionnaires ciliaires obtenus avec ce proto…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été financés par le Fonds européen de développement régional (FEDF), par le biais du Programme opérationnel régional Centro 2020 dans le cadre des projets CENTRO-01-0145-FEDER-00008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, et par le biais de la COMPÉTITION 2020 – Programme opérationnel pour la compétitivité et l’internationalisation et les fonds nationaux portugais via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., dans le cadre des projets UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, et les subventions individuelles SFRH/BD/141092/2008 2018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) et par Marie Curie Actions – IRG, 7e programme-cadre.

Materials

5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) Merck (Sigma Aldrich) F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody Thermo Fisher Scientific A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A21235
B27 supplement (50x), serum free Invitrogen (Gibco) 17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M Merck (Sigma Aldrich) AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate VWR 24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil Invitrogen (Gibco) 10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology Fisher Scientific 10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin Invitrogen (Gibco) 26050-070
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen (Gibco) 25030-081
Mouse laminin I Cultrex (R&D systems) 3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin Merck (Sigma Aldrich) T8578
Mouse monoclonal SV2 DSHB AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) Thermo Fisher Scientific 11874235
Neurobasal medium without glutamine Invitrogen (Gibco) 21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) Invitrogen (Gibco) 15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture Merck (Sigma Aldrich) P3532
Poly-D-Lysine Merck (Sigma Aldrich) P7886
Potassium chloride Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) 31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS Panreac Applichem 131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI Invitrogen (Gibco) P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk Fisher Scientific 10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) Peprotech 450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO Panreac Applichem 131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade Panreac Applichem 141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x) Thermo Fisher 11360039
Syringe without needle, 10 mL Thermo Fisher 11587292
Trypsin 1:250 powder Invitrogen (Gibco) 27250-018

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Cite This Article
Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. O., Pedro, J. R., Almeida, R. D. Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61431, doi:10.3791/61431 (2020).

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