Summary

Aislamiento y cultura de chick Ciliary Ganglion Neurons

Published: August 08, 2020
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Summary

Los ganglios ciliares son parte del sistema nervioso parasimpático. Cultivos neuronales de polluelos CG neuronas fueron demostrados para ser modelos celulares eficaces en el estudio de las interacciones musculares nerviosas. Describimos un protocolo detallado para la disección, disociación y cultivo in vitro de neuronas CG a partir de embriones de polluelos.

Abstract

Los polluelos ciliares (CG) son parte del sistema nervioso parasimpático y son responsables de la inervación de los tejidos musculares presentes en el ojo. Este ganglio está constituido por una población homogénea de neuronas ciliares y coroidales que inergen fibras musculares estriadas y lisas, respectivamente. Cada uno de estos tipos neuronales regulan las estructuras y funciones oculares específicas. Con los años, las culturas neuronales de los polluelos ganglios ciliares se demostraron para ser modelos celulares eficaces en el estudio de las interacciones del sistema músculo-nervioso, que se comunican a través de sinapsis colinérgicas. Las neuronas ganglionares ciliar son, en su mayoría, colinérgicas. Este modelo celular ha demostrado ser útil comparativamente a los modelos celulares heterogéneos utilizados anteriormente que comprenden varios tipos neuronales, además de colinérgicos. Anatómicamente, el ganglio ciliar se localiza entre el nervio óptico (ON) y la fisura coroides (CF). Aquí, describimos un procedimiento detallado para la disección, disociación y cultivo in vitro de neuronas ganglias ciliares de embriones de polluelos. Proporcionamos un protocolo paso a paso con el fin de obtener cultivos celulares altamente puros y estables de las neuronas CG, destacando los pasos clave del proceso. Estas culturas se pueden mantener in vitro durante 15 días y, por la presente, mostramos el normal desarrollo de las culturas CG. Los resultados también muestran que estas neuronas pueden interactuar con las fibras musculares a través de sinapsis colinérgicas neuromusculares.

Introduction

Las neuronas del ganglio ciliar (CG) pertenecen al sistema nervioso parasimpático. Estas neuronas son colinérgicas, pudiendo establecer sinapsis muscarnicas o nicotínicos1,2,3. Anatómicamente, el CG se encuentra en la parte posterior del ojo entre el nervio óptico (ON) y la fisura coroides (CF) y consiste en alrededor de 6000 neuronas en las primeras etapas embrionarias1,4. Durante la primera semana en el cultivo, las neuronas ganglionares ciliares presentan una morfología multipolar. Después de una semana, comienzan a pasar a un estado unipolar, con un neurito extendiendo y formando el axón5. Además, aproximadamente la mitad de las neuronas CG mueren entre eldía 8 y 14 del desarrollo del embrión del polluelo, a través de un proceso programado de muerte celular. Esta disminución en el número de neuronas resulta en una población total del ganglio ciliar de alrededor de 3000 neuronas6,7,8. In vitro, no hay reducción en el número de neuronas CG cuando se cultiva con células musculares9 y las neuronas CG se pueden cultivar durante varias semanas1,,9.

El ganglio ciliar consiste en una población homogénea de neuronas ciliares y neuronas coroideas, cada una representando la mitad de la población neuronal en el CG, inervando el músculo del ojo. Estos dos tipos de neuronas son estructural, anatómica y funcionalmente distintas. Las neuronas ciliares inerben las fibras musculares estriadas en el iris y la lente, siendo responsables de la contracción de la pupila. Las neuronas coroideas inerben el músculo liso de la coroides1,10,11,12.

Se ha demostrado que los cultivos de neuronas ganglionares ciliares de pollo son herramientas útiles para el estudio de las sinapsis neuromusculares y la formación de sinapsis1,5,9. Teniendo en cuenta que las sinapsis neuromusculares son colinérgicas13, utilizando una población neuronal que es colinérgico – CG neuronas – surgió como una alternativa potencial a los modelos celulares anteriores14. Estos modelos consistían en una población neuronal heterogénea, en la que sólo una pequeña parte es colinérgico. Alternativamente, las neuronas ganglionares ciliar se desarrollan relativamente rápido invitro, y después de aproximadamente 15 horas ya forman sinapsis1. Las neuronas CG se han utilizado como un sistema modelo a lo largo de los años para estudios de investigación distintos, debido a su relativa facilidad de aislamiento y manipulación. Estas aplicaciones incluyen estudios optogenéticos, desarrollo de sinapsis, apoptosis e interacciones neuromusculares14,15.

Describimos un procedimiento detallado para la disección, disociación y cultivo in vitro de neuronas gangliares ciliares de embriones de polluelos embrionarios día 7 (E7). Proporcionamos un protocolo paso a paso con el fin de obtener cultivos celulares altamente puros y estables de las neuronas colinérgicas. También destacamos los pasos clave del protocolo que requieren una atención especial y que mejorarán la calidad de las culturas neuronales. Estos cultivos se pueden mantener in vitro durante al menos 15 días.

Protocol

1. Preparación de reactivos NOTA: Los materiales necesarios para este procedimiento son los siguientes: fórceps (no 5 y no 55), pinzas quirúrgicas, disección de placas Petri (fondo negro), placas de 24 pocillos, pipeta de plástico Pasteur, pipeta Pasteur de vidrio pulido al fuego, jeringa de 10 ml, filtro de jeringa de 0,22 m. Preparar y esterilizar todo el material necesario para el protocolo, incluyendo cubreobjetos de vidrio, fórceps (no 5 y no 55), pinzas…

Representative Results

La duración estimada de este procedimiento depende estrechamente del rendimiento necesario para cada experimento específico y, por lo tanto, del número de ganglios ciliares que deben aislarse. Para un rendimiento estimado de 1 x 106 células/ml, aísle alrededor de 70 ganglios ciliares (35 huevos). Para este número de ganglios, tomará 2-3 horas para el procedimiento de disección y un total de 4-5 horas para el procedimiento total. En la Figura 1Ase muestra una ilustración p…

Discussion

En este protocolo, demostramos cómo preparar y cultivar las neuronas CG. La identificación y disección del ganglio ciliar puede ser difícil para los usuarios sin experiencia. Por lo tanto, presentamos un procedimiento detallado y paso a paso para diseccionar eficientemente los polluelos E7, disociar el tejido y preparar cultivos neuronales que se pueden mantener durante al menos 15 días. Las neuronas ganglionares ciliar obtenidas con este protocolo también son adecuadas para el cocultivo con células musculares.</p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), a través del Programa Operativo Regional Centro 2020 en el marco de los proyectos CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, y a través del PROGRAMA OPERACION 2020 – Programa Operativo para la Competitividad e Internacionalización y fondos nacionales portugueses a través de FCT – Fundación para una Ciudad Europea, I.P., en el marco de los proyectos UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, y las subvenciones individuales SFRH/BD/141092/12018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) y por Marie Curie Actions – IRG, 7th Framework Programme.

Materials

5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) Merck (Sigma Aldrich) F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody Thermo Fisher Scientific A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A21235
B27 supplement (50x), serum free Invitrogen (Gibco) 17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M Merck (Sigma Aldrich) AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate VWR 24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil Invitrogen (Gibco) 10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology Fisher Scientific 10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin Invitrogen (Gibco) 26050-070
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen (Gibco) 25030-081
Mouse laminin I Cultrex (R&D systems) 3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin Merck (Sigma Aldrich) T8578
Mouse monoclonal SV2 DSHB AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) Thermo Fisher Scientific 11874235
Neurobasal medium without glutamine Invitrogen (Gibco) 21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) Invitrogen (Gibco) 15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture Merck (Sigma Aldrich) P3532
Poly-D-Lysine Merck (Sigma Aldrich) P7886
Potassium chloride Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) 31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS Panreac Applichem 131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI Invitrogen (Gibco) P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk Fisher Scientific 10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) Peprotech 450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO Panreac Applichem 131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade Panreac Applichem 141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x) Thermo Fisher 11360039
Syringe without needle, 10 mL Thermo Fisher 11587292
Trypsin 1:250 powder Invitrogen (Gibco) 27250-018

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Cite This Article
Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. O., Pedro, J. R., Almeida, R. D. Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61431, doi:10.3791/61431 (2020).

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