בידוד ותרבות של צ'יק סילייון גנגליון נוירונים
Summary
גנגוליה (CG) היא חלק ממערכת העצבים הפאראסימפתטית. תרבויות נוירואליות של אפרוח CG הנוירונים הוכחו להיות מודלים תא יעיל במחקר של אינטראקציות שרירים עצביים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור הניתוח, דיסוציאציה ותרבות מבחנה של CG נוירונים מ עוברי האפרוח.
Abstract
גרעינים צ’יק (CG) הם חלק ממערכת העצבים הפאראסימפתטית ואחראים לאינבציה של רקמות השריר הקיימות בעין. גנגליון זה הוא היווה על ידי אוכלוסיה הומוגנית של choroidal ונוירונים הinnervate שרירי וחלקה סיבים, בהתאמה. כל אחד מסוגי עצבי אלה לווסת מבנים העין ספציפיים פונקציות. במהלך השנים, תרבויות עצביות של גנגוליה חומוס האפרוח הוכחו להיות מודלים תא יעיל במחקר של אינטראקציות שרירים מערכת העצבים, אשר מתקשרים דרך הסינפסות cholinergic. . ברוב הcholinergic מודל תא זה הוכח להיות שימושי יחסית בשימוש בעבר דגמי תאים הטרוגנית המהווים מספר סוגים עצביים, מלבד cholinergic. מבחינה אנטומית, גנגליון הסילארי מקומי בין העצב האופטי (ON) לבין הקרע הדמית (CF). כאן, אנו מתארים הליך מפורט עבור הניתוח, הדיסוציאציה ובתרבות מבחנה של הנוירונים גנגליה גרעינים מעוברי האפרוח. אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי להשיג תרבויות הסלולר טהור ויציב מאוד של CG נוירונים, הדגשת צעדי מפתח של התהליך. תרבויות אלה ניתן לשמור על מבחנה במשך 15 ימים, בזאת, אנו מראים את ההתפתחות הנורמלית של התרבויות CG. התוצאות מראות גם כי הנוירונים האלה יכולים לתקשר עם סיבי השריר באמצעות שרירי cholinergic הסינפסות הנוירולוגית.
Introduction
גנגליון (CG) נוירונים שייכים למערכת העצבים הפאראסימפתטית. הנוירונים האלה הם cholinergic, להיות מסוגל להקים מוסריריתיים או הסינפסות ניקולט1,2,3. אנטומית, CG ממוקם בחלק האחורי של העין בין העצב האופטי (על) ואת הקרע דמית (CF) ומורכב סביב 6000 נוירונים בשלבים העובריים המוקדמים1,4. בשבוע הראשון בתרבות, הניריונים גנגליון נוירונים להציג מורפולוגיה רב קוטבי. לאחר שבוע, הם מתחילים לעבור למצב חד קוטבי, עם אחד neurite הרחבה ויצירת אקסון5. בנוסף, כמחצית של הנוירונים למות CG בין היוםה -8 ו -14 של התפתחות העובר צ’יק, באמצעות תהליך מתוכנת של מוות התאים. ירידה זו מספר הנוירונים תוצאות באוכלוסייה הכוללת של גנגליון הגאנגרי של סביב 3000 נוירונים6,7,8. בתוך מבחנה, אין ירידה במספר של CG נוירונים כאשר גדל עם תאים שרירים9 ו-cg נוירונים יכול להיות מתורבת במשך מספר שבועות1,9.
גנגאריה מורכב מאוכלוסיה הומוגנית של נוירונים סיליברי ונוירונים choroidal, כל אחד מייצג חצי מהאוכלוסייה העצבית ב-CG, innervating שריר העין. שני סוגים אלה של נוירונים הם מבנית, מאנטומית ומבחינה פונקציונלית. הנוירונים סיליברי innervate סיבי השריר הסטריבטים על הקשתית והעדשה, האחראים על התכווצות האישון. Choroidal נוירונים innervate השריר החלק של הדמית1,10,11,12.
תרבויות של עוף בצורת גנגליון נוירונים הוכחו להיות כלים שימושיים לחקר הסינפסות נוירוסכולריות והיווצרות סינפסה1,5,9. בהתחשב בעובדה כי סינפסות נוירו-מולקולרית הם cholinergic13, באמצעות אוכלוסייה עצבית כי הוא CHOLINERGIC – CG נוירונים – התפתחה כחלופה פוטנציאלית דגמי התא הקודם14. מודלים אלה היו באוכלוסיה עצבית הטרוסוגלית, שבה רק חלק קטן הוא cholinergic. לחילופין, הנוירונים מתפתחים בצורה מהירה יחסית בתוך מבחנה, ולאחר כ -15 שעות כבר יוצרים את הסינפסות1. הנוירונים CG שימשו מערכת מודל לאורך השנים למחקרים מחקר ברורים, בשל קלות יחסית של בידוד ומניפולציה. יישומים אלה כוללים מחקרים אלקטרואופטיקה, התפתחות סינפסה, אפופטוזיס ואינטראקציות נוירוסקולריות14,15.
אנו מתארים הליך מפורט עבור הניתוח, הדיסוציאציה בתרבות מבחנה של הנוירונים גרעינים של מיום העובריים 7 (E7) בחורה עוברים. אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי לקבל תרבויות סלולר טהור ויציב מאוד של נוירונים cholinergic. אנו מדגישים גם את צעדי המפתח של הפרוטוקול הדורשים תשומת לב מיוחדת, ושישפרו את איכות התרבויות הנוירואליות. התרבויות הללו יכולות להישמר. באופן מתורבת לפחות 15 יום
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, הדגמנו כיצד להכין ותרבות CG הנוירונים. הזיהוי והניתוח של גנגאריה יכול להיות קשה עבור משתמשים לא מנוסים. לכן, אנו מציגים הליך מפורט צעד אחר צעד כדי לנתח ביעילות E7 צ’יק בחורה, הנתק את הרקמה ולהכין תרבויות נוירואליות כי ניתן לשמור לפחות 15 ימים. הנוירונים בתאי גנגאריה המתקבלים עם פ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו ממומנת על ידי הקרן האירופית לפיתוח האזור (ERDF), באמצעות המרכז 2020 הפעילות האזורית במסגרת פרויקטים סנטרו-01-0145-פדר-000008: בריאות המוח 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-000003 פדר: עמוד, מרכז-01-0246-פדר-00018: MEDISIS, ודרך להתחרות 2020-תוכנית מבצעית לתחרותיות ובאינטראוליזציה ופורטוגזית כספים באמצעות FCT – Fundação באמצעות פרויקטים UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-פדר-022122: PPBI, לפטין/סאו-ניו/104100/2008, ומענקים בודדים SFRH/BD/141092/2018 (md), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) ועל ידי פעולות מארי קירי-IRG, תוכנית המסגרת השביעית.
Materials
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
References
- Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
- Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Developmental Biology. 28, 407-429 (1972).
- Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
- Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
- Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
- Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
- Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
- Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
- Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
- Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
- Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
- Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
- Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
- Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
- Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
- Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
- Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
- Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
- Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
- Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
- Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
- Squire, L. R. . Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
- Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
- Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
- Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).
