İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden İndüklenen İn vitro Nöromüsküler Kavşak

1. Hücre dışı matriks (ECM) kaplamalı plakaların hazırlanması Seyreltik ECM (Bkz. Malzeme Tablosu)buz soğuğu 1x PBS ile %2’lik son konsantrasyona kadar. 50 mL plastik bir tüpe 1x PBS’den 49 mL’ye 1 mL ECM ekleyin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın. 6 kuyulu bir plakanın her kuyuya 1 kapak yerleştirin. Her kuyuya %2 ECM 1,5 mL ekleyin. Kuyu plakasını %2 ECM ile 37 °C’de 2 saat kuluçkaya yatırın. Kuyu plakasından ECM aspire edin ve kullanmadan önce plakayı 4 °C’de saklayın. 2. IPSC’lerin NMJ’ye Farklılaşması Bölüm 1’de5 hazırlanan 6 kuyulu plaka üzerinde her de iPSC’lerin 4 x 10 5’ini tohumlayın. Kapak kaymaüzerinde önceden depolanmış hücreler tohum emin olun.NOT: Bu çalışmada, 201B7MYOD iPS hücre hattı, Dr Sakurai’s Lab bir hediye,15kullanılmıştır. 6 cm kültür çanağı üzerindeki iPSC’lerden ortayı çıkarın ve iPSC’leri 1x PBS ile bir kez yıkayın. Çanağa 1 mL hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve 37 °C’de 10 dakika kuluçkaya yatırın. 3 mL primat embriyonik kök (ES) hücre ortamını tabağa ve pipete 3 kez hafifçe ekleyin. Müstakil iPSC’ler içeren supernatant’ı 50 mL plastik bir tüpe ve 160 x g’de 4 °C’de 5 dakika boyunca santrifüje toplayın. Supernatant’ı dikkatlice aspire edin, 10 μM Y27632 ile 3 mL primat ES hücre ortasındaki iPSC’leri yeniden askıya alın ve hemositometre kullanarak hücre numarasını sayın. Primat ES hücre ortası ve 10 μM Y27632 ile iPSC’leri 2 x 105 hücre/mL konsantrasyonuna seyreltin. Bölüm 1’de açıklanan kuyuya önceden yatırılan kapak fişine 2 mL iPSC ekleyin. iPSC’lerin NMJ’ye indüksiyonu 1. günde, 24 saat iPSC’leri 6 kuyulu plakaya tohumladıktan sonra, kültür ortamını çıkarın ve her kuyuya 1 μg/mL doksisiklin içeren 2 mL taze primat ES hücre li orta ile değiştirin. 1 μg/mL doksisiklin (son konsantrasyon) içeren 2 mL miyojenik farklılaşma ortamı (MDM)(Tablo 1)ile ortayı değiştirin. Ortamı 2 günden 10.güne kadar her gün yenileyin. 11. günden itibaren, orta yı 2 mL NMJ orta(Tablo 1)ile her kuyuya çevirin. 30 gün sonraya kadar her 3\u20124 gün orta yenileyin. 30. günde faz ters mikroskopi ile farklılaştırılmış NMJ’yi gözlemleyin. NMJ aşağıdaki analiz için kullanılabilir. 3. İmmünofluoresans (IF) boyama 30. günde, 6 kuyulu tabaktan kültür ortamını aspire edin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her kuyuya 2 mL %4 paraformaldehit ekleyerek NMJ kültürünü düzeltin. Her kuyuya 2 mL 1x PBS ekleyerek numuneleri 3 kez yıkayın (her yıkama için 3 dk). 10 dakika boyunca % 0.1 Triton/PBS ile numuneleri permeabilize edin. Adımı 3.2’yi tekrarlayın. Numuneleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca %0,5 BSA ile engelleyin. Adımı 3.2’yi tekrarlayın. Numuneleri bir gecede 4 °C’de birincil antikorlarla kuluçkaya yatırın. Antikorların seyreltilmesi aşağıdaki gibidir: Adacık 1 (1 μg/mL), miyozin ağır zincir (MYH) (1/300), nörofilamentler (NF) (1 μg/mL), S-100 (1/300), sinaptik vezikül proteini 2 (SV2) (1 g/mL), Tuj1 (1/1000). Adımı 3.2’yi tekrarlayın. Numuneleri oda sıcaklığında ikincil antikorlarla 1 saat kuluçkaya yatırın. Kullanılan ikincil antikorların konsantrasyonu aşağıdaki gibidir: anti-fare IgG 488 konjuge (0.1 μg/mL), anti-tavşan IgG 488 konjuge (0.1 μg/mL). Adımı 3.2’yi tekrarlayın. Numuneleri AChR boyama için aBTX-647 (0,5 g/mL) ve çekirdek boyama için DAPI (1 μg/mL) ile kuluçkaya yatırın. Adımı 3.2’yi tekrarlayın. 6-iyi plaka forseps bir çift ile coverslip pick up ve bir mikroskop slayt% 50 gliserol / PBS çözeltisi monte. 4. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) 0,1 M potasyum fosfat tamponunda hazırlanan %4 paraformaldehit ve %1 glutaraldehit ile 1 saat oda sıcaklığında NMJ kültürünü düzeltin. Örnekleri oda sıcaklığında 0,1 M potasyum fosfat tamponuna batırarak (her yıkama için 10 dk) 3 kez yıkayın. Etanol konsantrasyonları artan örnekleri dehydrate (, 70%, 90%, 95% ve 100% iki kez). 10 dakika boyunca etanol her konsantrasyonda örnekleri batırın. Numuneleri kritik bir nokta kurutucu (-30 °C, 0,1 Torr) ile kurutun. Pt (platin) iyon kaplamalı numuneleri katleyin (3 dk için 30 mA; Pt kalınlığı yaklaşık 20 nm’ dir). 5 kV’da SEM örneklerini gözlemleyin. 5. İletim elektron mikroskobu (TEM) NMJ kültür plaka doku hasat için bir hücre kazıyıcı kullanın. Bir jilet ve jel sarılı parça oluşturmak için jelleşme tarafından tutkal ile küçük bir pelet (3 mm3)içine doku şekli. Jel sarılı parçayı bir gecede 4 °C’de 0,1 M potasyum fosfat tamponunda hazırlanan %2 paraformaldehit ve %2 glutaraldehit ile sabitle. Örnekleri oda sıcaklığında 0,1 M potasyum fosfat tamponuna (her yıkama için 15 dk) batırarak 3 kez yıkayın. Çift distile H2O oda sıcaklığında 1 saat için hazırlanan% 1 osmiyum tetroksit ile örnekler postfix.DİkKAT: Bu adım kimyasal bir başlık içinde yapılmalıdır. Adımı 5.2’yi tekrarlayın. Etanol konsantrasyonları artan örnekleri dehydrate (, 70%, 90%, 95% ve 100% iki kez). 10 dakika boyunca etanol her konsantrasyonda örnekleri batırın. % 100 etanol aspire. Epoksi reçine hacmi artan hacim oranları ile% 100 etanol karışımları (1:3, 1:1 ve 3:1) için örnekleri sızma. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 10 rpm’de her karışımı hafifçe karıştırın. Epoksi-etanol karışımını saf epoksi reçine ile değiştirin ve oda sıcaklığında 4 saat boyunca 10 rpm’de hafifçe çalkalayın. 4 saat sonra, taze epoksi reçine ile epoksi reçine yenileyin ve oda sıcaklığında geceleme 10 rpm hafifçe ajite. Numuneleri taze epoksi reçine ile gömme kapsüllerine yerleştirin ve numuneleri bir gecede 65 °C’de bir fırında tedavi edin. Ultramikrotomi Doğru yönlendirme için numune bloklarını bir diseksiyon mikroskobu altında kaba bir şekilde kırpın. Pürüzsüz yüzeyler elde etmek için ultramikrotom üzerinde cam bir bıçakla iri kesilmiş blokları ince bir şekilde kırpın. Bir elmas bıçak ile iyi kesilmiş bloklardan 70 nm ultraince bölümler hazırlayın. 200 örgü karbon formvar kaplı bakır ızgaralı ultra ince bölümleri alın. Çift distile H2O’da hazırlanan doymuş uranyal asetat içeren ultra ince kesitleri 30 dakika boyunca lekelendirin ve ızgaraları 3 kez çift distile H2O (her yıkama için 10 dk) ile yıkayın. Ayrıca, ultraince bölümleri Reynold’un kurşun sitrat19 (%2,5) ile kontrast 5 dakika boyunca ve haşlanmış H2O ile yıkanan önceden oda sıcaklığına 3 kez (her yıkama için 10 dk) önceden soğutulmuş. Bölümlerde CO2 yağışını önlemek için boyama alanının etrafına birkaç sodyum hidroksit pelet koyun. TEM’in ultra ince bölümlerini 70 kV’da gözlemleyin. 6. Kas kasılması ve curare tedavisi Myotube daralmasını tetiklemek için, 2.3 adımda kültür ortamına 25 mM CaCl2 ekleyin. Miyotubeların hareketi 1\u20122 dk.da görülebilir. 6 kuyulu plakayı ters bir mikroskopun sahnesine yerleştirin. Canlı hücre mikroskobu ile miyotube kontraksiyonunun bir filmini kaydedin. Myotube kontraksiyonu durdurmak için kültür ortamına curare ekleyin (300 ng/mL). Sonra filmi adım 6.2 olarak kaydedin. Hareket vektör analiz yazılımı ile film dosyasını açın ve filmi analiz etmek için Hareket Analizi düğmesini tıklatın.NOT: Miyotubes daralması zaman hareketi grafiği olarak gösterilir. Filmler miyotubeların hareket hızını göstermek için renk kodludur. Renk kodlu ışıltılı sinyaller, kırmızı rengin en hızlı hareket hızını gösterdiği miyotubeların hareketlerini ve mavi rengin en yavaş hareket hızını gösterir.