Aqui fornecemos um protocolo para gerar NMJs in vitro a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Este método pode induzir NMJs com morfologia madura e função em 1 mês em um único poço. Os NMJs resultantes poderiam potencialmente ser usados para modelar doenças relacionadas, para estudar mecanismos patológicos ou para rastrear compostos medicamentosos para terapia.
A junção neuromuscular (NMJ) é uma sinapse especializada que transmite potenciais de ação do neurônio motor ao músculo esquelético para movimento mecânico. A arquitetura da estrutura do NMJ influencia as funções do neurônio, do músculo e da interação mútua. Estudos anteriores relataram muitas estratégias co-culminando os neurônios motores e miotubes para gerar NMJ in vitro com processo de indução complexo e longo período de cultura, mas têm lutado para recapitular a morfologia e função NMJ maduras. Nosso sistema de indução in vitro NMJ é construído diferenciando iPSC humano em um único prato de cultura. Ao trocar o meio de indução miogênica e neurogênica por indução, o NMJ resultante continha componentes pré e pós-sinápticos, incluindo neurônios motores, músculo esquelético e células schwann na cultura de um mês. O ensaio funcional do NMJ também mostrou que a contração dos miotubes pode ser desencadeada por Ca++ então inibida pelo curare, um inibidor do receptor de acetilcolina (AChR), no qual o sinal estimulante é transmitido através de NMJ. Esta abordagem simples e robusta deriva com sucesso a complexa estrutura do NMJ com conectividade funcional. Este NMJ humano in vitro, com suas estruturas e função integradas, tem potencial promissor para estudar mecanismos patológicos e triagem composta.
A junção neuromuscular (NMJ) é uma sinapse especializada que transmite sinais de neurônios motores para músculos esqueléticos para controlar o movimento muscular voluntário1,,2. Esta sinapse é composta de partes pré e pós-sinápticas. Na parte pré-sináptica, o neurônio motor libera acetilcolina (ACh) de vesículas sinápticas por exocitose. ACh é liberado de vesículas sinápticas para atravessar a fissura sináptica e ligar-se ao AChR na parte pós-sináptica para desencadear um potencial de ação para contração muscular3,,4. Qualquer defeito nesta estrutura delicada pode causar doenças de NMJ, incluindo atrofia muscular espinhal (SMA), síndromes miasthenic congênitas (CMS), myasthenia gravis (MG)5,,6,,7, etc. Essas doenças prejudicam muito a qualidade de vida dos pacientes e, infelizmente, não têm abordagens efetivas de tratamento devido à falta de compreensão do mecanismo patológico. Neste estudo, tivemos como objetivo gerar NMJ humano in vitro a partir de iPSCs humanos para modelagem precisa de doenças e para triagem de compostos terapêuticos.
Estudos anteriores demonstraram a possibilidade de gerar NMJ in vitro por estratégias de cocultura. Os neurônios motores e os miótubos esqueléticos são gerados, respectivamente. Os dois tipos de células podem ser gerados a partir de culturas de tecido primário humano ou camundongo ou induzidos a partir de células-tronco8,,9,,10,11 e, emseguida,co-cultivados para a formação de NMJ. As outras aplicações incluem a fusão do NMJ co-cultivado em dispositivos 3D microfluidos e o uso de unidades optogenéticas para ensaios funcionais quantificáveis12,,13. No entanto, essas estratégias levam um longo período de cultura e requerem luta para obter os componentes primários do NMJ, seja o neurônio motor ou o mióbo esquelético simultaneamente. Outro componente importante do NMJ, a célula Schwann, não pode ser gerado nesses sistemas culturais. O sistema de cultura avançada que contém o miotube, neurônio motor e célula Schwann é desejável, pois pode oferecer um modelo confiável e robusto para estudos de NMJ.
A Diferenciação Miogênica 1 (MYOD1) é um conhecido regulador miogênico para miogênese14. O eficiente método de diferenciação miogênica que aplicou MYOD1 para conduzir o iPSC em miotubes foi construído em um estudo anterior15. Por isso, induzimos os miotubes ao superexpressar o MYOD1 nos iPSCs15, e mostrou-se alta eficiência da diferenciação miogênica. Curiosamente, as células neurônios apareceram junto com os miotubes espontaneamente após o dia 10. O aparecimento de células neurônios na cultura miogênica nos levou a desenvolver a estratégia para gerar NMJ in vitro em um único prato. Aqui fornecemos uma estratégia para gerar NMJs, superexpressando MYOD1 em iPSCs humanos para indução de neurônios miogênicos e motores no mesmo prato de cultura. Os neurônios motores são induzidos espontaneamente com vários fatores neurotróficos (GDNF, BDNF, NT3, etc.) 8, e, enquanto isso, as células Schwann também podem ser induzidas16,17. Através das interações entre os miótubos, os neurônios motores e as células Schwann, o NMJ maduro é formado18. Este método pode gerar NMJ funcional de forma eficiente, possibilitando o estudo potencial de mecanismos patológicos e triagem de compostos terapêuticos.
Estudos anteriores relataram métodos para formação de NMJ in vitro com métodos sofisticados que requerem cultura de longo prazo8,,10,,12,,13,,20. Essas conquistas lideram a progressão do NMJ in vitro. No entanto, as complicadas metodologias dificultaram o acesso dos estudos do NMJ. Nosso protocolo evita a co-cultura para gerar NMJs de forma eficiente e robusta em um único poço. Três tipos de células no NMJ foram observados em nosso sistema de indução, incluindo os miotubes, os neurônios motores e as células Schwann18. Além disso, foram verificadas morfologia madura e função.
Com base em nosso estudo anterior, a densidade celular inicial é um fator crítico para a formação de NMJ, e diferentes densidades celulares induzem vários números de NMJs na cultura18. Uma baixa densidade celular (< 1 x 104/cm2) induziu um baixo número de neurônios, o que é desfavorável para a formação de NMJ. Embora seja necessário muito mais tempo e recursos para preparar uma densidade maior de células (> 1 x 105/cm2), recomendamos que a densidade celular esteja entre 1,5 x 104/cm2 e 5 x 104/cm2 usando nosso protocolo. O NMJ gerado por este protocolo é um tecido heterogêneo com múltiplos tipos de células que está mais perto de imitar condições fisiológicas. Os miótubos são encontrados para distribuir uniformemente em um prato de cultura, mas os neurônios motores aparecem aleatoriamente, dos quais o fenômeno resulta na distribuição desigual de NMJs em uma cultura. Este NMJ é adequado para estudos qualitativos em vez da análise que exige sistemas de cultura homogêneos. Também usamos outras linhas de celular, eq., H9 (linha celular ES)18 e A11 (linha de célula iPS, dados não mostrados) para gerar NMJ por este protocolo. O NMJ pode ser gerado com sucesso em morfologia e função. A condição cultural, no entanto, precisa ser otimizada para diferentes linhas celulares.
A contração quimicamente desencadeada de miotubes e a inibição dependente de curare confirmaram que nosso NMJ in vitro era funcional e poderia ser potencialmente aplicado para ensaios práticos. Contrações musculares espontâneas foram observadas aleatoriamente em 3\u20124 semanas de cultura, mas poderia ser evitada estendendo o tempo de cultura para até doismeses 18.
Várias estratégias foram publicadas para a geração de NMJ in vitro de diferentes estágios de maturação, mas o NMJ in vitro gerado em nosso sistema mostrou a maturidade significativa, pois podemos observar a transição de subunidades gama para epsilon de AChR durante a cultura18. A maturidade é uma consideração importante para a modelagem de doenças com NMJ in vitro21. Em conclusão, um NMJ in vitro com componentes estruturais integrados, maturidade e função é de uso potencial para o desenvolvimento terapêutico.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Dr. Sakurai por fornecer gentilmenteMYOD201B7 . O estudo de microscopia eletrônica foi apoiado por Keiko Okamoto-Furuta e Haruyasu Kohda (Divisão de Estudos Microscópicos eletrônicos, Centro de Estudos Anatômicos, Escola de Pós-Graduação em Medicina da Universidade de Kyoto). O anticorpo monoclonal foi desenvolvido pela HHMI/Columbia University, obtido do Banco Hybridoma de Estudos de Desenvolvimento, criado pelo Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano do NIH, e mantido no Departamento de Biologia da Universidade de Iowa. Agradecemos também a Shiori Oshima, Kazuhiro Nakagawa e Eriko Matsui pela análise de vetores de movimento. Este trabalho foi apoiado por financiamento da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência KAKENHI, números de subvenção 16H05352 e 20H03642 (para MKS); Fundo de Pesquisa celular do iPS (para CYL e MKS); Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research (para MKS); Takeda Science Foundation (para MKS); e uma bolsa do Programa de Pesquisa de Doenças Intratáveis utilizando células iPS específicas para doenças, que foi auxiliada pela Agência japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico (17935400 para CYL e MKS, e 17935423 para mks).
Medium, growth factors and reagents | Item | Brand | Cat. Number |
2-mercaptoethanol | Nacalai tesque | 21418-42 | |
B27, Gibco | Gibco | 12587-001 | |
BDNF | R & D Systems | 248-BD | |
Cell detachment solution, Accumax | STEMCELL Technologies | #07921 | |
Critical point dryer | Hitachi | ES-2030 | |
Doxycycline | Takara | 631311 | |
ECM, Matrigel (growth factor reduced) | Corning | 356230 | |
GDNF | R & D Systems | 212-GD | |
Gelation, IP gel | Geno Staff | PG20-1 | |
Ions coater | JEOL | JEC3000FC | |
iPSC medium, mTeSR | STEMCELL Technologies | 85850 | |
KnockOut SR (KSR) | Gibco | 10828-028 | |
live cell microscopy | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
MEM-alpha | Gibco | 12571-071 | |
Motion vector analysis software | Sony | SI8000 | |
N2, Gibco | Gibco | 17502-048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
NT3 | R & D Systems | 267-N3 | |
Primate ES cell medium | ReproCell | RCHEMD001 | |
SEM | Hitachi | S-4700 | |
TEM | Hitachi | H7650 | |
Y27632 | Wako Chemicals GmbH | 253-00513 | |
Antibodies | Brand | Cat. Number | Dilutions |
Molecular Probes | B3545 | 0.5 ug/ml | |
Islet 1 | DSHB | 40.2D6 | 1/100 |
Myosin heavy chain (MYH) | MilliporeSigma | A4.1025 | 1/300 |
Neurofilaments (NF) | MilliporeSigma | MAB5254 | 1/500 |
S-100 | Abcam | ab14849 | 1/300 |
Synaptic vesicle protein 2 (SV2) | DSHB | SV2 | 1/50 |
Tuj1 | Covance | MMS435P | 1/1000 |