في المختبر العصبي العضلي تقاطع الناجمة عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة الإنسان
Summary
هنا نقدم بروتوكول لتوليد NMJs في المختبر من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs). يمكن أن تحفز هذه الطريقة NMJs مع مورفولوجيا ناضجة وظيفة في 1 شهر في بئر واحد. ويمكن استخدام NMJs الناتجة عن ذلك لنموذج الأمراض ذات الصلة، لدراسة الآليات المرضية أو لفحص مركبات المخدرات للعلاج.
Abstract
الوصلة العصبية العضلية (NMJ) هو المشبك المتخصص الذي ينقل إمكانات العمل من الخلايا العصبية الحركية إلى العضلات الهيكلية للحركة الميكانيكية. الهندسة المعمارية للبنية NMJ يؤثر على وظائف الخلايا العصبية، والعضلات والتفاعل المتبادل. وقد أبلغت الدراسات السابقة العديد من الاستراتيجيات من خلال المشاركة في زراعة الخلايا العصبية الحركية وميوتوب لتوليد NMJ في المختبر مع عملية تحريض معقدة وفترة ثقافة طويلة ولكن ناضلت لتكخيص مورفولوجيا NMJ ناضجة والوظيفة. تم بناء نظامنا التعريفي NMJ في المختبر عن طريق التمييز بين iPSC البشري في طبق ثقافة واحد. عن طريق تبديل وسيط التعريفي ميوجيني وعصبية للتحريض، و NMJ الناتجة تحتوي على مكونات ما قبل وما بعد متشابك، بما في ذلك الخلايا العصبية الحركية، والعضلات والهيكل العظمي وخلايا شوان في ثقافة شهر واحد. كما أظهرت الفحص الوظيفي لـ NMJ أن انكماش اليوتوب يمكن أن يسببه Ca++ ثم يمنعه كوراري، وهو مثبط مستقبلات أستيل (AChR)، حيث تنتقل الإشارة المحفزة عبر NMJ. هذا النهج البسيط والقوي نجح في استخلاص الهيكل المعقد لـ NMJ مع الاتصال الوظيفي. هذا في المختبر NMJ الإنسان، مع هياكلها المتكاملة ووظيفتها، لديه إمكانات واعدة لدراسة الآليات المرضية والفحص المركب.
Introduction
تقاطع العصبية العضلية (NMJ) هو المشبك المتخصصة التي تنقل إشارات من الخلايا العصبية الحركية إلى عضلات الهيكل العظمي للسيطرة على حركة العضلات الطوعية1,2. يتكون هذا المشبك من أجزاء ما قبل وما بعد متشابك. في الجزء قبل متشابك, الخلايا العصبية الحركية النشرات أستيل (ACh) من vesicles متشابك بواسطة exocytosis. يتم تحرير ACh من الفيليات متشابك لعبور الشق متشابك وربط ل AChR على جزء ما بعد متشابك لتحريك العمل المحتملة لانكماش العضلات3,4. أي خلل في هذا الهيكل الدقيق يمكن أن يسبب أمراض NMJ ، بما في ذلك ضمور العضلات الشوكي (SMA) ، والمتلازمات الوهنائي الخلقية (CMS) ، الوهن العضلي العضلي الوبيل (MG)5،6،7، إلخ. هذه الأمراض تلحق ضررا كبيرا بنوعية حياة المرضى وللأسف ليس لديها نهج العلاج الفعال بسبب عدم فهم الآلية المرضية. في هذه الدراسة، ونحن تهدف إلى توليد في المختبر NMJ الإنسان من iPSCs الإنسان لنمس النمذجة المرض دقيقة وللفحص المركبات العلاجية.
وقد أظهرت الدراسات السابقة إمكانية توليد NMJ في المختبر من خلال استراتيجيات الثقافة المشتركة. يتم إنشاء الخلايا العصبية الحركية وتيوبات الهيكل العظمي على التوالي. يمكن توليد نوعين من الخلايا من الثقافات البشرية أو الماوس الأنسجة الأولية أو أن يكون مستحثا من الخلايا الجذعية8,9,10,11 ومن ثم شارك في تربية تشكيل NMJ. وتشمل التطبيقات الأخرى دمج NMJ المشتركة في الثقافة في أجهزة microfluidic 3D واستخدام وحدات optogenetic لقاسم قابل للقياس الكميوظيفية 12,13. ومع ذلك، هذه الاستراتيجيات تأخذ فترة طويلة الثقافة وتتطلب النضال من أجل الحصول على المكونات الأساسية ل NMJ، إما الخلايا العصبية الحركية أو الهيكل العظمي myotube في وقت واحد. ومع ذلك، لا يمكن إنشاء مكون هام آخر من مكونات NMJ، وهو خلية شوان، في هذه النظم الثقافية. نظام الثقافة المتقدمة التي تحتوي على ميوتوب, الخلايا العصبية الحركية وخلية شوان هو مرغوب فيه كما أنه يمكن أن تقدم نموذجا موثوقا وقويا للدراسات NMJ.
تمايز ميوجيني 1 (MYOD1) هو منظم ميوجينيك المعروفة لesiogenesi14. تم بناء طريقة التمايز الميوجينية الفعالة التي طبقت MYOD1 لدفع iPSC في myotubes في دراسة سابقة15. ولذلك، نحن مستحثة myotubes عن طريق overexpressing MYOD1 في iPSCs15، وظهرت كفاءة عالية من التمايز الميوجين. ومن المثير للاهتمام، ظهرت الخلايا العصبية جنبا إلى جنب مع myotubes تلقائيا بعد اليوم 10. وقد أدى ظهور الخلايا العصبية في الثقافة ميوجيني لنا لتطوير استراتيجية لتوليد NMJ في المختبر في طبق واحد. هنا نقدم استراتيجية لتوليد NMJs عن طريق overexing MYOD1 في iPSCs الإنسان لتحريض الخلايا العصبية الحركية وميوجيني في طبق الثقافة نفسها. يتم حث الخلايا العصبية الحركية تلقائيا مع العديد من العوامل العصبية (GDNF، BDNF، NT3، الخ.) 8، وفي الوقت نفسه ، يمكن أيضا أن تكون الخلايا Schwann الناجمة16،17. من خلال التفاعلات بين ميوتوبس, الخلايا العصبية الحركية وخلايا Schwann, يتم تشكيل NMJ ناضجة18. يمكن لهذه الطريقة توليد NMJ وظيفية بكفاءة، مما يتيح الدراسة المحتملة للآليات المرضية وفحص المركبات العلاجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أفادت الدراسات السابقة أساليب تشكيل NMJ في المختبر مع أساليب متطورة تتطلب ثقافة طويلة الأجل8,10,12,13,20. هذه الإنجازات تؤدي إلى التقدم في المختبر NMJ. ومع ذلك، أعاقت المنهجيات المعقدة الوصول إلى دراسات الجهاز الوطني لجمهورية أقليات. بروتوكولنا يتجنب الثقافة المشتركة لتوليد NMJs بكفاءة وقوة في بئر واحدة. وقد لوحظت ثلاثة أنواع الخلايا في NMJ في نظام الحث لدينا, بما في ذلك ميوتيوب, الخلايا العصبية الحركية وخلايا Schwann18. وبالإضافة إلى ذلك، تم التحقق من مورفولوجيا ناضجة وظيفة.
استنادا إلى دراستنا السابقة، وكثافة الخلايا الأولية هو عامل حاسم لتشكيل NMJ، وكثافات الخلايا المختلفة تحفز أعداد مختلفة من NMJs في ثقافة18. تسبب كثافة الخلايا المنخفضة (< 1 × 104/ سم2) عددًا منخفضًا من الخلايا العصبية ، وهو غير موات لتشكيل NMJ. على الرغم من أن الأمر سيستغرق المزيد من الوقت والموارد لإعداد كثافة أعلى من الخلايا (> 1 × 105/ سم2)، نوصي بأن تكون كثافة الخلية بين 1.5 × 104/ سم2 و 5 × 104/ سم2 باستخدام بروتوكولنا. NMJ التي تم إنشاؤها بواسطة هذا البروتوكول هو نسيج غير متجانسة مع أنواع الخلايا المتعددة التي هي أقرب إلى محاكاة الظروف الفسيولوجية. تم العثور على myotubes لتوزيع بالتساوي على طبق الثقافة ولكن الخلايا العصبية الحركية تظهر بشكل عشوائي ، والتي تؤدي هذه الظاهرة إلى التوزيع غير المتكافئ ل NMJs في ثقافة. هذا الجهاز هو مناسبة للدراسات النوعية بدلا من التحليل الذي يتطلب نظم ثقافة متجانسة. كما استخدمنا خطوط الخلية الأخرى، eq.، H9 (ES خط الخلية)18 و A11 (خط الخلية iPS، لا تظهر البيانات) لتوليد NMJ بواسطة هذا البروتوكول. يمكن إنشاء NMJ بنجاح في مورفولوجيا ودالة. ومع ذلك، فإن حالة الثقافة تحتاج إلى تحسين خطوط الخلايا المختلفة.
وأكد انكماش اليوتيوب التي تسبب كيميائيا وتثبيط كوراري تعتمد على أن لدينا في المختبر NMJ كان وظيفيا ويمكن أن تطبق يحتمل أن تكون لتحاليل عملية. وقد لوحظ تقلصات العضلات عفوية عشوائيا في 3\u20124 أسابيع من الثقافة، ولكن يمكن تجنبها عن طريق تمديد الوقت الثقافة إلى ما دام شهرين18.
وقد نشرت استراتيجيات مختلفة لتوليد في المختبر NMJ مراحل نضوج مختلفة، ولكن NMJ في المختبر ولدت في نظامنا أظهرت النضج الكبير، كما يمكننا أن نلاحظ انتقال غاما إلى وحدات فرعية ابسيلون من AChR خلال الثقافة18. النضج هو اعتبار مهم للأمراض النمذجة مع NMJ في المختبر21. في الختام ، NMJ في المختبر مع مكونات هيكلية متكاملة ، والنضج وظيفة من الاستخدام المحتمل للتنمية العلاجية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور ساكراي على التكرم بتوفير 201B7MYOD. وقد دعم دراسة المجهر الإلكتروني كيكو أوكاموتو-فوروتا وهاروياسو كوهدا (شعبة الدراسة المجهرية الإلكترونية، مركز الدراسات التشريحية، كلية الدراسات العليا للطب، جامعة كيوتو). تم تطوير الجسم المضاد أحادي النسيلة من قبل جامعة HHMI/ كولومبيا ، تم الحصول عليها من بنك الدراسات التنموية الهجينة ، الذي أنشأه المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية في المعاهد القومية للصحة ، وحافظ عليه في قسم البيولوجيا ، جامعة أيوا. ونشكر أيضا شيوري أوشيما، وكازوهيرو ناكاغاوا، وإريكو ماتسوي على تحليل ناقلات الحركة. وقد تم دعم هذا العمل بتمويل من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم KAKENHI، وعدد المنح 16H05352 و 20H03642 (إلى MKS)؛ صندوق بحوث الخلايا iPS (إلى CYL وMKS)؛ مؤسسة موخيدا التذكارية للبحوث الطبية والصيدلانية (إلى MKS)؛ مؤسسة تاكيدا للعلوم (إلى MKS)؛ و منحة من برنامج أبحاث الأمراض المستعصية باستخدام خلايا iPS الخاصة بالأمراض، والتي ساعدتها الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (17935400 إلى CYL و MKS، و 17935423 إلى MKS).
Materials
| Medium, growth factors and reagents | Item | Brand | Cat. Number |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai tesque | 21418-42 | |
| B27, Gibco | Gibco | 12587-001 | |
| BDNF | R & D Systems | 248-BD | |
| Cell detachment solution, Accumax | STEMCELL Technologies | #07921 | |
| Critical point dryer | Hitachi | ES-2030 | |
| Doxycycline | Takara | 631311 | |
| ECM, Matrigel (growth factor reduced) | Corning | 356230 | |
| GDNF | R & D Systems | 212-GD | |
| Gelation, IP gel | Geno Staff | PG20-1 | |
| Ions coater | JEOL | JEC3000FC | |
| iPSC medium, mTeSR | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| KnockOut SR (KSR) | Gibco | 10828-028 | |
| live cell microscopy | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| MEM-alpha | Gibco | 12571-071 | |
| Motion vector analysis software | Sony | SI8000 | |
| N2, Gibco | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| NT3 | R & D Systems | 267-N3 | |
| Primate ES cell medium | ReproCell | RCHEMD001 | |
| SEM | Hitachi | S-4700 | |
| TEM | Hitachi | H7650 | |
| Y27632 | Wako Chemicals GmbH | 253-00513 | |
| Antibodies | Brand | Cat. Number | Dilutions |
| Molecular Probes | B3545 | 0.5 ug/ml | |
| Islet 1 | DSHB | 40.2D6 | 1/100 |
| Myosin heavy chain (MYH) | MilliporeSigma | A4.1025 | 1/300 |
| Neurofilaments (NF) | MilliporeSigma | MAB5254 | 1/500 |
| S-100 | Abcam | ab14849 | 1/300 |
| Synaptic vesicle protein 2 (SV2) | DSHB | SV2 | 1/50 |
| Tuj1 | Covance | MMS435P | 1/1000 |
References
- Hong, I. H. K., Etherington, S. J. Neuromuscular Junction. eLS. , (2001).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
- Slater, C. R. The Structure of Human Neuromuscular Junctions: Some Unanswered Molecular Questions. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2183 (2017).
- Comley, L. H., Nijssen, J., Frost-Nylen, J., Hedlund, E. Cross-disease comparison of amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy reveals conservation of selective vulnerability but differential neuromuscular junction pathology. Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1424-1442 (2016).
- Shigemoto, K., et al. Muscle weakness and neuromuscular junctions in aging and disease. Geriatrics & Gerontology International. 10, 137-147 (2010).
- Abicht, A., Müller, J., Lochmüller, H. Congenital Myasthenic Syndromes. GeneReviews. , (2016).
- Faravelli, I., et al. Motor neuron derivation from human embryonic and induced pluripotent stem cells: experimental approaches and clinical perspectives. Stem Cell Research & Therapy. 5 (4), 87-100 (2014).
- Demestre, M., et al. Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes. Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).
- Yoshida, M., et al. Modeling the early phenotype at the neuromuscular junction of spinal muscular atrophy using patient-derived iPSCs. Stem Cell Reports. 4 (4), 561-568 (2015).
- Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. A system for studying mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance. Development. 143 (13), 2464-2477 (2016).
- Uzel, S. G. M., et al. Microfluidic device for the formation of optically excitable, three-dimensional, compartmentalized motor units. Science Advances. 2 (8), 1501429 (2016).
- Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
- Tanaka, A., et al. Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro. PLoS One. 8 (4), 61540 (2013).
- Furlan, A., Adameyko, I. Schwann cell precursor: a neural crest cell in disguise. Developmental Biology. 444, 25-35 (2018).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. Schwann Cell Precursors; Multipotent Glial Cells in Embryonic Nerves. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12 (69), (2019).
- Lin, C. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2019).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Steinbeck, J. A., et al. Functional Connectivity under Optogenetic Control Allows Modeling of Human Neuromuscular Disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
- Bucchia, M., Merwin, S. J., Re, D. B., Kariya, S. Limitations and Challenges in Modeling Diseases Involving Spinal Motor Neuron Degeneration in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 61 (2018).
