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Developmental Biology

In vitro Neuromuskuläre Junction Induziert von humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen

Published: December 03, 2020
doi:
10.3791/61396
, , ,
1Department of Clinical Application, Center for iPS Cell Research and Application (CiRA),Kyoto University, 2Department of Pediatrics,Kyoto Prefectural University of Medicine, 3Graduate Institute of Clinical Medicine,Taipei Medical University

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von In-vitro-NMJs aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zur Verfügung. Diese Methode kann NMJs mit ausgereifter Morphologie und Funktion in 1 Monat in einem einzigen Brunnen induzieren. Die daraus resultierenden NMJs könnten potenziell verwendet werden, um verwandte Krankheiten zu modellieren, pathologische Mechanismen zu untersuchen oder medikamentöse Verbindungen für die Therapie zu untersuchen.

Abstract

Die neuromuskuläre Kreuzung (NMJ) ist eine spezialisierte Synapse, die Aktionspotentiale vom motorischen Neuron an den Skelettmuskel für mechanische Bewegungen überträgt. Die Architektur der NMJ-Struktur beeinflusst die Funktionen des Neurons, des Muskels und der gegenseitigen Interaktion. Frühere Studien haben viele Strategien berichtet, indem sie die motorischen Neuronen und Myotuben mitkultivierthaben, um NMJ in vitro mit komplexem Induktionsprozess und langer Kulturperiode zu erzeugen, aber sie haben Schwierigkeiten, reife NMJ-Morphologie und Funktion zu rekapitulieren. Unser In-vitro-Induktionssystem NMJ wird durch die Differenzierung von humanen iPSC in einem einzigen Kulturgericht konstruiert. Durch die Umstellung des myogenen und neurogenen Induktionsmediums auf Induktion enthielt das resultierende NMJ prä- und postsynaptische Komponenten, einschließlich motorischer Neuronen, Skelettmuskeln und Schwannzellen in der einmonatigen Kultur. Der funktionelle Test von NMJ zeigte auch, dass die Myotubekontraktion durch Ca++ ausgelöst und dann durch Curare, einen Acetylcholin-Rezeptor (AChR)-Hemmer, gehemmt werden kann, bei dem das stimulierende Signal durch NMJ übertragen wird. Dieser einfache und robuste Ansatz leitete erfolgreich die komplexe Struktur von NMJ mit funktionaler Konnektivität ab. Dieser in vitro humane NMJ mit seinen integrierten Strukturen und Funktionen hat vielversprechendes Potenzial für die Untersuchung pathologischer Mechanismen und des zusammengesetzten Screenings.

Introduction

Die neuromuskuläre Kreuzung (NMJ) ist eine spezialisierte Synapse, die Signale von motorischen Neuronen an Skelettmuskeln überträgt, um die freiwillige Muskelbewegung1,2zu steuern. Diese Synapse besteht aus prä- und postsynaptischen Teilen. Im präsynaptischen Teil setzt das motorische Neuron Acetylcholin (ACh) durch Exozytose aus synaptischen Vesikeln frei. ACh wird von synaptischen Vesikeln freigesetzt, um den synaptischen Spalten zu überqueren und an AChR auf dem postsynaptischen Teil zu binden, um ein Aktionspotenzial für Muskelkontraktionauszulösen 3,4. Jede Fehlfunktion in dieser empfindlichen Struktur kann NMJ-Erkrankungen verursachen, einschließlich spinaler Muskelatrophie (SMA), angeborenen myasthenischen Syndromen (CMS), Myasthenia gravis (MG)5,6,7, etc. Diese Krankheiten beeinträchtigen die Lebensqualität der Patienten erheblich und haben leider keine wirksamen Behandlungsansätze, da der pathologische Mechanismus nicht verstanden wird. In dieser Studie wollten wir in vitro humanes NMJ aus humanen iPSCs für eine genaue Krankheitsmodellierung und für das Screening therapeutischer Verbindungen generieren.

Frühere Studien haben die Möglichkeit der Erzeugung von In-vitro-NMJ durch Co-Kultur-Strategien gezeigt. Die motorischen Neuronen und Skelettmyotuben werden bzw. erzeugt. Die beiden Zelltypen können aus primären Gewebekulturen des Menschen oder der Maus erzeugt oder aus den Stammzellen8,,9,,10,,11 induziert und dann für die NMJ-Bildung mitkultiviert werden. Die weiteren Anwendungen umfassen die Zusammenführung des ko-kultivierten NMJ zu mikrofluidischen 3D-Geräten und die Verwendung optogenetischer Einheiten für quantifizierbare funktionelle Assays12,13. Diese Strategien dauern jedoch eine lange Kulturperiode und erfordern Kampf, um die primären Komponenten des NMJ zu erhalten, entweder das motorische Neuron oder das Skelett myotube gleichzeitig. Ein weiterer wichtiger Bestandteil von NMJ, die Schwann-Zelle, kann in diesen Kultursystemen nicht erzeugt werden. Das fortschrittliche Kultursystem, das die Myotube, das motorische Neuron und die Schwann-Zelle enthält, ist wünschenswert, da es ein zuverlässiges und robustes Modell für NMJ-Studien bieten kann.

Myogenic Differentiation 1 (MYOD1) ist ein bekannter myogener Regulator für Myogenese14. Die effiziente myogene Differenzierungsmethode, mit der MYOD1 iPSC in Myotubes eingebunden hat, wurde in einer früheren Studie15erstellt. Daher induzierten wir die Myotuben durch Überexexzessieren von MYOD1 in iPSCs15, und es wurde eine hohe Effizienz der myogenen Differenzierung gezeigt. Interessanterweise tauchten Neuronenzellen zusammen mit Myotuben spontan nach Tag 10 auf. Das Auftreten von Neuronenzellen in der myogenen Kultur hat uns dazu gebracht, die Strategie zur Erzeugung von In-vitro-NMJ in einem einzigen Gericht zu entwickeln. Hier bieten wir eine Strategie zur Generierung von NMJs, indem wir MYOD1 in humanen iPSCs für myogene und motorische Neuroneninduktion in der gleichen Kulturschale überexzessieren. Die motorischen Neuronen werden spontan mit mehreren neurotrophen Faktoren induziert (GDNF, BDNF, NT3, etc.) 8, und in der Zwischenzeit können die Schwann-Zellen auch induziert werden16,17. Durch die Wechselwirkungen zwischen den Myoröhren, den motorischen Neuronen und den Schwann-Zellen bilden sich die reifen NMJ18. Diese Methode kann funktionelles NMJ effizient erzeugen und ermöglicht die mögliche Untersuchung pathologischer Mechanismen und therapeutisches Zusammengesetztenscreening.

Protocol

1. Herstellung extrazellulärer Matrixplatten (ECM)-beschichtete Platten ECM (siehe Materialtabelle) mit eiskaltem 1x PBS auf eine Endkonzentration von 2% verdünnen. Fügen Sie 1 ml ECM zu 49 ml 1x PBS in einem 50 ml Kunststoffrohr hinzu. Mischen Sie gut, indem Sie mehrmals nach oben und unten. Legen Sie 1 Abdeckungslip in jeden Brunnen einer 6-Well-Platte. Fügen Sie 1,5 ml von 2% ECM in jeden Brunnen ein. Inkubieren Sie die Brunnenplatte mit 2% ECM für 2 h bei 37 °C. ECM von der Brunnenplatte absaugen und vor Gebrauch bei 4 °C lagern. 2. Differenzierung von iPSCs in Richtung NMJ Samen 4 x 105 iPSCs pro Brunnen auf der 6-Well-Platte, die in Abschnitt 1 hergestellt wird. Achten Sie darauf, die Zellen auf dem Deckslip vorgelagert in den Brunnen zu säen.HINWEIS: In dieser Studie wurde die 201B7MYOD iPS Zelllinie, ein Geschenk von Dr. Sakurai es Lab,verwendet 15. Entfernen Sie das Medium von den iPSCs auf der 6 cm Kulturschale und waschen Sie die iPSCs einmal mit 1x PBS. 1 ml Zellablösung in die Schale geben und 10 min bei 37 °C brüten. Fügen Sie 3 ml Primaten-Embryonalstamm (ES) Zellmedium in die Schale und Pipette 3 mal sanft. Sammeln Sie den Überstand, der abgetrennte iPSCs enthält, in ein 50 ml Kunststoffrohr und eine Zentrifuge bei 160 x g bei 4 °C für 5 min. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an, setzen Sie die iPSCs in 3 ml Primaten-ES-Zellmedium mit 10 M Y27632 wieder aus und zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer. Verdünnen Sie die iPSCs mit Primaten-ES-Zellmedium und 10 m Y27632 auf eine Konzentration von 2 x 105 Zellen/ml. Fügen Sie 2 ml iPSCs auf dem Deckschein hinzu, der in dem in Abschnitt 1 beschriebenen Brunnen vorgelagert ist. Induktion der iPSCs in NMJ Entfernen Sie am 1. Tag 24 h nach dem Aussaat der iPSCs auf die 6-Well-Platte das Kulturmedium und ersetzen Sie es durch 2 ml frisches Primaten-ES-Zellmedium, das jeweils 1 g/ml Doxycyclin enthält. Ändern Sie das Medium mit 2 ml myogenem Differenzierungsmedium (MDM) (Tabelle 1) mit 1 g/ml Doxycyclin (Endkonzentration) auf jeden Brunnen. Erfrischen Sie das Medium jeden Tag von Tag 2 bis Tag 10. Wechseln Sie ab Dem 11. Tag das Medium auf 2 ml NMJ medium (Tabelle 1) auf jeden Brunnen. Erfrischen Sie das Medium alle 3-u20124 Tage danach bis zum 30. Tag. Beobachten Sie das differenzierte NMJ durch Phaseninvertierte Mikroskopie am 30. Tag. Das NMJ kann für die folgende Analyse verwendet werden. 3. Immunfluoreszenz (IF) Färbung An Tag 30, aspirieren Sie das Kulturmedium aus der 6-Well-Platte. Beheben Sie die NMJ-Kultur, indem Sie jedem Brunnen 30 min bei Raumtemperatur 2 ml 4% Paraformaldehyd hinzufügen. Waschen Sie die Proben 3 Mal, indem Sie 2 ml 1x PBS zu jedem Brunnen hinzufügen (3 min für jede Wäsche). Permeabilisieren Sie die Proben mit 0,1% Triton/PBS für 10 min. Wiederholen Sie Schritt 3.2. Blockieren Sie die Proben mit 0,5% BSA für 1 h bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie Schritt 3.2. Inkubieren Sie die Proben mit den primären Antikörpern bei 4 °C über Nacht. Die Verdünnung der Antikörper ist wie folgt: Islet 1 (1 g/ml), Myosin schwere Kette (MYH) (1/300), Neurofilamente (NF) (1 g/ml), S-100 (1/300), synaptischeves Vesikelprotein 2 (SV2) (1 g/ml), Tuj1 (1/1000). Wiederholen Sie Schritt 3.2. Inkubieren Sie die Proben mit den sekundären Antikörpern bei Raumtemperatur für 1 h. Die Konzentration der verwendeten Sekundärantikörper ist wie folgt: Anti-Maus-IgG 488 konjugiert (0,1 g/ml), Anti-Kaninchen-IgG 488 konjugiert (0,1 g/ml). Wiederholen Sie Schritt 3.2. Inkubieren Sie die Proben mit aBTX-647 (0,5 g/ml) für aChR-Färbung und mit DAPI (1 g/ml) für die Kernfärbung. Wiederholen Sie Schritt 3.2. Nehmen Sie den Deckelrutsch mit einem Zangenpaar von der 6-Well-Platte auf und montieren Sie ihn in 50% Glycerin/PBS-Lösung auf einem Mikroskopschlitten. 4. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Fixieren Sie die NMJ-Kultur mit 4% Paraformaldehyd und 1% Glutaraldehyd, das in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer bei Raumtemperatur für 1 h hergestellt wird. Waschen Sie die Proben 3 Mal, indem Sie sie in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer bei Raumtemperatur (10 min für jede Wäsche) eintauchen. Dehydrieren Sie die Proben mit aufsteigenden Ethanolkonzentrationen (50%, 70%, 90%, 95% und 100% zweimal). Tauchen Sie die Proben in jede Ethanolkonzentration für 10 min ein. Trocknen Sie die Proben mit einem kritischen Punkttrockner (-30 °C, 0,1 Torr). Beschichten Sie die Proben mit Pt (Platin) Ionenlacker (30 mA für 3 min; Dicke von Pt ist ca. 20 nm). Beobachten Sie die Proben von SEM bei 5 kV. 5. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Verwenden Sie einen Zellschaber, um das Gewebe von der NMJ-Kulturplatte zu ernten. Das Gewebe mit einer Rasierklinge zu einem kleinen Pellet (3 mm3)formen und durch Gelation zu einem gelumhüllten Stück kleben. Fixieren Sie das gelverpackte Stück mit 2% Paraformaldehyd und 2% Glutaraldehyd, das in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer über Nacht bei 4 °C hergestellt wird. Waschen Sie die Proben 3 Mal, indem Sie sie bei Raumtemperatur in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (15 min für jede Wäsche) eintauchen. Nachbefestigen Sie die Proben mit 1% Osmiumtetroxid, das in doppeldestilliertemH2O für 1 h bei Raumtemperatur hergestellt wird.VORSICHT: Dieser Schritt muss in einer chemischen Haube durchgeführt werden. Wiederholen Sie Schritt 5.2. Dehydrieren Sie die Proben mit aufsteigenden Ethanolkonzentrationen (50%, 70%, 90%, 95% und 100% zweimal). Tauchen Sie die Proben in jede Ethanolkonzentration für 10 min ein. Aspirieren Sie das 100% Ethanol. Infiltrieren Sie die Proben mit aufsteigenden Volumenverhältnissen von Epoxidharz zu 100% Ethanolmischungen (1:3, 1:1 und 3:1). Rühren Sie jede Mischung bei 10 Rpm für 1 h bei Raumtemperatur sanft. Die Epoxid-Ethanol-Mischung durch reines Epoxidharz ersetzen und bei 10 Umdrehungen bei 10 Umdrehungen bei 4 h bei Raumtemperatur sanft rühren. Nach 4 h das Epoxidharz mit frischem Epoxidharz erfrischen und bei 10 Umdrehungen bei Raumtemperatur sanft bei 10 Umdrehungen rühren. Die Proben in Einbettkapseln mit frischem Epoxidharz einbetten und die Proben über Nacht bei 65 °C im Ofen aushärten. Ultramikrotomie Die Probenblöcke unter einem Seziermikroskop grob trimmen, um die richtige Ausrichtung zu erhalten. Die grob getrimmten Blöcke mit einem Glasmesser auf einem Ultramikrotom fein schneiden, um glatte Oberflächen zu erhalten. 70 nm ultradünne Abschnitte aus den gut getrimmten Blöcken mit einem Diamantmesser vorbereiten. Holen Sie sich die ultradünnen Abschnitte mit 200 Mesh-Carbon-Formvar-beschichteten Kupfergittern. Die ultradünnen Abschnitte mit Gittern mit gesättigtem Uranylacetat, die in doppelt destillierter H2O für 30 min hergestellt werden, beflecken und die Gitter 3 mal mit doppelt destilliertem H2O (10 min für jede Wäsche) waschen. Vergleichen Sie die ultradünnen Abschnitte mit Reynolds Bleicitrat19 (2,5%) für 5 min und waschen sie mit gekochtem H2O vorgekühlt auf Raumtemperatur 3 mal (10 min für jede Wäsche). Legen Sie mehrere Natriumhydroxidpellets um die2 Färbefläche, um CO2-Ausfällungen auf den Abschnitten zu verhindern. Beobachten Sie die ultradünnen Abschnitte von TEM bei 70 kV. 6. Muskelkontraktion und Curare-Behandlung Um die Myotube-Kontraktion auszulösen, fügen Sie 25 mM CaCl2 in Schritt 2.3 in das Kulturmedium ein. Die Bewegung von Myotuben kann in 1’u20122 min beobachtet werden. Legen Sie die 6-Well-Platte auf die Bühne eines invertierten Mikroskops. Nehmen Sie einen Film von Myotube Kontraktion durch Live-Zellmikroskopie auf. Um die Myotube-Kontraktion zu stoppen, fügen Sie Curare dem Kulturmedium (300 ng/mL) hinzu. Nehmen Sie dann den Film als Schritt 6.2 auf. Öffnen Sie die Filmdatei mit der Bewegungsvektoranalysesoftware und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Bewegungsanalyse, um den Film zu analysieren.HINWEIS: Die Myotubekontraktion wird als Zeitlupengrafik angezeigt. Die Filme sind farbcodiert, um die Bewegungsgeschwindigkeit von Myotubes anzuzeigen. Die farbcodierten Funksignale zeigen die Bewegungen von Myoröhren an, bei denen die rote Farbe die schnellste Bewegungsgeschwindigkeit und die blaue Farbe die langsamste Bewegungsgeschwindigkeit anzeigt.

Representative Results

Mit unserer Differenzierungsstrategie zeigte die Kultur an Tag 30 prä- und postsynaptische Komponenten des NMJ. Die NMJ-Komponenten wurden induziert und in einem einzigen Brunnen gut entwickelt, und ihre Morphologie und Ihre Positionen im NMJ wurden durch IF-Mikroskopie demonstriert (Abbildung 1). Das Flussdiagramm in Abbildung 1A fasst den Zeitlichenverlauf der NMJ-Differenzierungsprogression zusammen. Die Färbung von Neurofilamenten (NF), synaptischen Vesikeln (SV2) und AChR (Abbildung 1B,C) zeigt die Neuronen an. Die einzelnen Färbungsbilder von NF und SV2 sind in der Ergänzenden Abbildung 1dargestellt. Die Alpha-Bungarotoxin-Färbung zeigt AChR (Abbildung 1C). Das zusammengeführte Bild zeigt die relativen Positionen eines Motorneurons und AChR im NMJ (Abbildung 1D,E). Der zweite Satz von IF Färbung zeigt das motorische Neuron von Tuj1 und Islet 1 (Abbildung 1G,H) und postsynaptische Myotuben durch Myosin schwere Kette (Abbildung 1I). Die Schwann-Zellen wurden auch durch S-100-Antikörper in der NMJ-Kultur gekennzeichnet (Ergänzende Abbildung 2). Um die Identität der NMJ-Komponenten weiter zu bestätigen, haben wir SEM für detaillierte morphologische Analysen verwendet. Ausgereifte NMJ-Morphologie mit expandierten Axonklemmen, Axonen und Muskelfasern sind in Abbildung 2A,Bdargestellt. TEM wurde durchgeführt, um die ausgereifte Ultrastruktur der NMJ-Komponenten einschließlich der präsynaptischen Axonklemme mit synaptischen Vesikeln und des postsynaptischen Teils, der durch den synaptischen Spalten getrennt ist, zu offenbaren (Abbildung 2C-u2012E). Junctionale Falten werden durch die gelbe gestrichelte Linie angezeigt, die die Kreuzung von Neuron und Muskelfasern markiert (Abbildung 2C). Die ausgereiften Axonklemmen, die synaptische Vesikel enthalten, sind in Abbildung 2D,E (gelbe Pfeile) dargestellt. Die morphologischen Ergebnisse zeigen, dass die NMJ-Komponenten gut induziert und gereift waren. Um die Funktion des In-vitro-NMJ zu bewerten, führten wir eine Bewegungsanalyse durch, indem wir das motorische Neuron mit CaCl2 stimulierten, um Myotube-Kontraktionen auszulösen. Die Ergebnisse zeigten, dass Ca2+ Muskelkontraktionen auslösen kann. Die Kontraktionen könnten durch Curare unterbrochen werden. Das NMJ zeigte prominente Bewegungssignale, die mit Curare-Behandlung verschwanden (Abbildung 3). Dieser Effekt bestätigt, dass die motorischen Neuronsignale durch das NMJ übertragen wurden, um Muskelkontraktion auszulösen. Zusammengenommen zeigten die IF-Mikroskopie-, SEM- und TEM-Daten die räumliche Verteilung, Morphologie und Reife der NMJ-Komponenten im in vitro NMJ, das durch das oben beschriebene Protokoll erzeugt wurde. Die Bewegungsanalyse validierte die Funktion des In-vitro-NMJ, was seine mögliche Anwendung bei der Entwicklung therapeutischer Strategien impliziert. Abbildung 1: Flussdiagramm für NMJ-Induktion und IF-Bilder der NMJ-Kultur. (A) Ein Flussdiagramm für die NMJ-Differenzierungsprogression. (B-2012F) Nachweis von NMJ-Komponenten, Neurofilamenten (NF), synaptischen Vesikeln (SV2) und AChR. Die weißen Pfeile in Panel D zeigen den NMJ an. (G-u2012K) Vor- und nachsynaptische Komponenten des NMJ. Tuj1 und Islet1 zeigen das motorische Neuron an, und Myosin schwere Kette (MYH) zeigt die Myotube an. a-BTX, Alpha-Bungarotoxin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: SEM- und TEM-Bilder von ausgereiftem NMJ. (A) Die räumliche Verteilung der NMJ-Komponenten zeigt die Axonklemme, die auf der Oberfläche der Muskelfaser (Mf) verankert ist. (B) Eine höhere Vergrößerung des NMJ zeigt die Axonklemmen. (C) Die Ultrastruktur eines gereiften NMJ mit präsynaptischen Axonklemmen (rote Pfeilspitzen) und synaptischen Vesikeln (Sv), synaptischen Spalten (Sc) und postsynaptischen Teilen (rote Pfeile). Knotenfalten (jf) werden durch die gelbe gestrichelte Linie angezeigt. Ax, Axon. (D, E) Die Hohen Vergrößerungsbilder zeigen die synaptischen Vesikel in Axonklemmen (gelbe Pfeile). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Myotuben Kontraktionsanalyse von In-vitro-NMJ. Myotubekontraktion wurde mit 25 mM CaCl2 Lösung (grüne Linie) ausgelöst. Die Kontraktionen wurden nach behandlung mit Curare (gelbe Linie) gehemmt. Siehe auch Supplementary Movie 1 und Supplementary Movie 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ergänzender Film 1: Die myotubenkontraktion ausgelöst durch Ca++. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen. Ergänzungsfilm 2: Die viel schwächere Kontraktion von Myotuben nach Curare-Behandlung wird gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen. Ergänzende Abbildung 1: Die einzelnen Färbungsbilder von Neurofilamenten (NF, weiße Pfeile) in der NMJ-Kultur. Die einzelnen Färbungsbilder von synaptischen Vesikeln (SV2, weiße Pfeile) in der NMJ-Kultur. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen. Ergänzende Abbildung 2: Die Schwann-Zellen, die von S-100-Antikörpern in der NMJ-Kultur gekennzeichnet sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen. Myogenes Differenzierungsmedium (MDM) MEM-alpha 500mL 100mM 2-ME 1117 x L Doxycyclin 1 g/ml Ksr 56ml (Endstand bis 10%) Stift/Strep 2,5 ml gesamt 560mL 100mM 2-Mercaptoethanol 2-Mercaptoethanol 7-L d.d. Wasser 993 x L gesamt 1000 l NMJ mittel Neurobasales Medium (NB) 500mL B27 1x (Lager in 50x) Bdnf 10ng/ml GDNF 10ng/ml N2 1x (Lager in 100x) NT3 10ng/ml Stift/Strep 2,5 ml Tabelle 1: Formel des Mediums.

Discussion

Frühere Studien haben Methoden zur NMJ-Bildung in vitro mit ausgeklügelten Methoden berichtet, die eine langfristige Kultur erfordern8,10,12,13,20. Diese Errungenschaften führen zum Fortschreiten von In-vitro-NMJ. Die komplizierten Methoden behinderten jedoch den Zugang zu NMJ-Studien. Unser Protokoll vermeidet Co-Kultur, um NMJs effizient und robust in einem einzigen Brunnen zu generieren. Drei Zelltypen im NMJ wurden in unserem Induktionssystem beobachtet, darunter die Myotuben, die motorischen Neuronen und die Schwann-Zellen18. Darüber hinaus wurden ausgereifte Morphologie und Funktion überprüft.

Basierend auf unserer vorherigen Studie ist die anfängliche Zelldichte ein kritischer Faktor für die NMJ-Bildung, und verschiedene Zelldichten induzieren verschiedene Zahlen von NMJs in der Kultur18. Eine geringe Zelldichte (< 1 x 104/cm2) induzierte eine geringe Anzahl von Neuronen, was für die NMJ-Bildung ungünstig ist. Obwohl es viel mehr Zeit und Ressourcen in Anspruch nehmen würde, um eine höhere Dichte von Zellen vorzubereiten (> 1 x 105/cm2), empfehlen wir, dass die Zelldichte zwischen 1,5 x 104/cm2 und 5 x 104/cm2 mit unserem Protokoll liegen sollte. Das durch dieses Protokoll erzeugte NMJ ist ein heterogenes Gewebe mit mehreren Zelltypen, das näher an der Nachahmung physiologischer Bedingungen liegt. Die Myotubes werden gefunden, um gleichmäßig auf einem Kulturgericht zu verteilen, aber die motorischen Neuronen erscheinen zufällig, von denen das Phänomen führt in der ungleichmäßigen Verteilung von NMJs in einer Kultur. Dieses NMJ eignet sich für qualitative Studien anstelle der Analyse, die homogene Kultursysteme erfordert. Wir verwendeten auch andere Zelllinien, eq., H9 (ES-Zelllinie)18 und A11 (iPS-Zelllinie, Daten nicht gezeigt), um NMJ durch dieses Protokoll zu generieren. Der NMJ kann erfolgreich in Morphologie und Funktion generiert werden. Der Kulturzustand muss jedoch für verschiedene Zelllinien optimiert werden.

Die chemisch ausgelöste Myotubekontraktion und curare-abhängige Hemmung bestätigten, dass unser in vitro NMJ funktional war und möglicherweise für praktische Assays angewendet werden konnte. Spontane Muskelkontraktionen wurden zufällig bei 3-u20124 Wochen Kultur beobachtet, aber es könnte vermieden werden, indem die Kulturzeit auf so lange wie zwei Monate18verlängert wird.

Verschiedene Strategien wurden veröffentlicht, um In-vitro-NMJ verschiedener Reifungsstadien zu erzeugen, aber das in unserem System erzeugte In-vitro-NMJ zeigte die signifikante Reife, da wir den Übergang von Gamma zu Epsilon-Untereinheiten von AChR während der Kultur18beobachten können. Reife ist eine wichtige Überlegung für die Krankheitsmodellierung mit In-vitro-NMJ21. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein In-vitro-NMJ mit integrierten Strukturkomponenten, Reife und Funktion für die therapeutische Entwicklung von Nutzen ist.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Sakurai für die freundliche Bereitstellung 201B7MYOD. Die Elektronenmikroskopie-Studie wurde von Keiko Okamoto-Furuta und Haruyasu Kohda (Division of Electron Microscopic Study, Center for Anatomical Studies, Graduate School of Medicine, Kyoto University) unterstützt. Der monoklonale Antikörper wurde von der HHMI/Columbia University entwickelt, die von der Developmental Studies Hybridoma Bank gewonnen wurde, die vom National Institute Child Health and Human Development des NIH gegründet wurde und am Department of Biology der University of Iowa gepflegt wird. Wir danken auch Shiori Oshima, Kazuhiro Nakagawa und Eriko Matsui für die Bewegungsvektoranalyse. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI, Grant Numbers 16H05352 und 20H03642 (zu MKS) unterstützt; iPS Cell Research Fund (zu CYL und MKS); Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research (zu MKS); Takeda Science Foundation (zu MKS); und ein Stipendium des Programms für intractable Diseases Research unter Verwendung krankheitsspezifischer iPS-Zellen, das von der Japan Agency for Medical Research and Development (17935400 bis CYL und MKS und 17935423 zu MKS) unterstützt wurde.

Materials

Medium, growth factors and reagents Item Brand Cat. Number
2-mercaptoethanol Nacalai tesque 21418-42
B27, Gibco Gibco 12587-001
BDNF R & D Systems 248-BD
Cell detachment solution, Accumax STEMCELL Technologies #07921
Critical point dryer Hitachi ES-2030
Doxycycline Takara 631311
ECM, Matrigel (growth factor reduced) Corning 356230
GDNF R & D Systems 212-GD
Gelation, IP gel Geno Staff PG20-1
Ions coater JEOL JEC3000FC
iPSC medium, mTeSR STEMCELL Technologies 85850
KnockOut SR (KSR) Gibco 10828-028
live cell microscopy Nikon Eclipse Ti microscope
MEM-alpha Gibco 12571-071
Motion vector analysis software Sony SI8000
N2, Gibco Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103-049
NT3 R & D Systems 267-N3
Primate ES cell medium ReproCell RCHEMD001
SEM Hitachi S-4700
TEM Hitachi H7650
Y27632 Wako Chemicals GmbH 253-00513
Antibodies Brand Cat. Number Dilutions
Molecular Probes B3545 0.5 ug/ml
Islet 1 DSHB 40.2D6 1/100
Myosin heavy chain (MYH) MilliporeSigma A4.1025 1/300
Neurofilaments (NF) MilliporeSigma MAB5254 1/500
S-100 Abcam ab14849 1/300
Synaptic vesicle protein 2 (SV2) DSHB SV2 1/50
Tuj1 Covance MMS435P 1/1000
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References

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Lin, C., Yoshida, M., Li, L., Saito, M. K. In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (166), e61396, doi:10.3791/61396 (2020).
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