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Developmental Biology

Jonction neuromusculaire in vitro induite par les cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Published: December 03, 2020
doi:
10.3791/61396
, , ,
1Department of Clinical Application, Center for iPS Cell Research and Application (CiRA),Kyoto University, 2Department of Pediatrics,Kyoto Prefectural University of Medicine, 3Graduate Institute of Clinical Medicine,Taipei Medical University

Summary

Ici, nous fournissons un protocole pour générer des NMJ in vitro à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (IPSCs). Cette méthode peut induire NMJs avec la morphologie mûre et la fonction en 1 mois dans un puits simple. Les NMJ qui en résultent pourraient potentiellement être utilisés pour modéliser des maladies connexes, étudier des mécanismes pathologiques ou dépister les composés médicamenteux pour la thérapie.

Abstract

La jonction neuromusculaire (NMJ) est une synapse spécialisée qui transmet les potentiels d’action du neurone moteur au muscle squelettique pour le mouvement mécanique. L’architecture de la structure NMJ influence les fonctions du neurone, du muscle et de l’interaction mutuelle. Des études antérieures ont rapporté de nombreuses stratégies en co-culture des neurones moteurs et des myotubes pour générer NMJ in vitro avec un processus d’induction complexe et une longue période de culture, mais ont lutté pour récapituler la morphologie et la fonction matures de NMJ. Notre système in vitro d’induction NMJ est construit en différeciant l’iPSC humain dans un plat de culture unique. En changeant le milieu myogénique et névrogène d’induction pour l’induction, le NMJ résultant a contenu des composants pré- et post-synaptiques, y compris des neurones moteurs, le muscle squelettique et les cellules de Schwann dans la culture d’un mois. L’analyse fonctionnelle du NMJ a également montré que la contraction des myotubes peut être déclenchée par Ca++ puis inhibée par le curare, un inhibiteur du récepteur de l’acétylcholine (AChR), dans lequel le signal stimulant est transmis par NMJ. Cette approche simple et robuste a réussi à tirer la structure complexe de NMJ avec une connectivité fonctionnelle. Ce NMJ humain in vitro, avec ses structures et fonctions intégrées, a un potentiel prometteur pour étudier les mécanismes pathologiques et le dépistage composé.

Introduction

La jonction neuromusculaire (NMJ) est une synapse spécialisée qui transmet des signaux des neurones moteurs aux muscles squelettiques pour contrôler le mouvement musculairevolontaire 1,2. Cette synapse est composée de parties pré et post-synaptiques. Dans la partie présynaptique, le neurone moteur libère l’acétylcholine (ACh) des vésicules synaptiques par exocytose. ACh est libéré des vésicules synaptiques pour traverser la fente synaptique et se lier à AChR sur la partie post-synaptique pour déclencher un potentiel d’action pour la contraction musculaire3,4. Tout dysfonctionnement de cette structure délicate peut causer des maladies NMJ, y compris l’atrophie musculaire spinale (SMA), les syndromes myasthéniques congénitaux (CMS), la myasthénie gravis (MG)5,6,7, etc. Ces maladies endommagent considérablement la qualité de vie des patients et n’ont malheureusement pas d’approches thérapeutiques efficaces en raison du manque de compréhension du mécanisme pathologique. Dans cette étude, nous voulions générer in vitro NMJ humain à partir d’iPSCs humains pour la modélisation précise des maladies et pour le dépistage des composés thérapeutiques.

Des études antérieures ont démontré la possibilité de générer in vitro NMJ par des stratégies de co-culture. Les neurones moteurs et les myotubes squelettiques sont générés respectivement. Les deux types de cellules peuvent être générés à partir de cultures de tissus primaires humains ou muraux ou être induits à partirde cellules souches 8,9,10,11, puis co-cultivés pour la formation de NMJ. Les autres applications incluent la fusion du NMJ co-cultivé en dispositifs 3D microfluidiques et l’utilisation d’unités optogénétiques pour des analyses fonctionnelles quantifiables12,13. Cependant, ces stratégies prennent une longue période de culture et nécessitent la lutte pour obtenir les composants primaires du NMJ, soit le neurone moteur ou le myotube squelettique simultanément. Une autre composante importante du NMJ, la cellule de Schwann, ne peut pas être générée dans ces systèmes culturels. Le système de culture avancée qui contient le myotube, le neurone moteur et la cellule de Schwann est souhaitable car il peut offrir un modèle fiable et robuste pour les études NMJ.

La différenciation myogénique 1 (MYOD1) est un régulateur myogénique bien connu pour la myogenèse14. La méthode efficace de différenciation myogénique qui a appliqué MYOD1 pour conduire iPSC dans les myotubes a été construite dans une étude précédente15. Par conséquent, nous avons induit les myotubes en surexprimant MYOD1 dans iPSCs15, et l’efficacité élevée de la différenciation myogénique a été montrée. Fait intéressant, les cellules de neurones sont apparues avec des myotubes spontanément après le jour 10. L’apparition de cellules neuronales dans la culture myogénique nous a conduits à développer la stratégie pour générer in vitro NMJ dans un seul plat. Ici, nous fournissons une stratégie pour générer des NMJs en surexprimant MYOD1 dans les iPSCs humains pour l’induction myogénique et des neurones moteurs dans le même plat de culture. Les neurones moteurs sont induits spontanément avec plusieurs facteurs neurotrophiques (GDNF, BDNF, NT3, etc.) 8, et, dans le même temps, les cellules de Schwann peuvent également êtreinduites 16,17. Grâce aux interactions entre les myotubes, les neurones moteurs et les cellules de Schwann, les NMJ matures sont formés18. Cette méthode peut générer le NMJ fonctionnel efficacement, permettant l’étude potentielle des mécanismes pathologiques et du criblage thérapeutique composé.

Protocol

1. Préparation de plaques enduites de matrice extracellulaire (ECM) Diluer l’ECM (voir tableau desmatériaux) avec du 1x PBS glacé à une concentration finale de 2 %. Ajouter 1 mL d’ECM à 49 mL de 1x PBS dans un tube en plastique de 50 mL. Bien mélanger en faisant monter et descendre plusieurs fois. Placer 1 coverslip dans chaque puits d’une assiette de 6 puits. Ajouter 1,5 mL de 2 % d’ECM dans chaque puits. Incuber la plaque de puits avec 2% d’ECM pendant 2 h à 37 °C. Aspirer l’ECM de la plaque du puits et conserver la plaque à 4 °C avant utilisation. 2. Différenciation des iPSC vers le NMJ Graine 4 x 105 iPSC par puits sur la plaque de 6 puits préparée à la section 1. Assurez-vous d’ensemencer les cellules sur le coverslip pré-déposé dans le puits.REMARQUE : Dans cette étude, la lignée cellulaireMYOD iPS 201B7, un cadeau du Laboratoire du Dr Sakurai, a étéutilisée 15. Retirer le milieu des iPSC sur le plat de culture de 6 cm et laver les iPSCs une fois avec 1x PBS. Ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire au plat et incuber pendant 10 min à 37 °C. Ajouter 3 mL de tige embryonnaire primate (ES) milieu cellulaire au plat et pipette 3 fois doucement. Recueillir le supernatant, qui contient des iPSC détachés, dans un tube en plastique de 50 mL et centrifugeuse à 160 x g à 4 °C pendant 5 min. Aspirez soigneusement le supernatant, resuspendez les iPSC dans le milieu cellulaire es primate de 3 mL avec 10 μM Y27632, et comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Diluer les iPSC avec le milieu cellulaire es primate et 10 μM Y27632 à une concentration de 2 x 105 cellules/mL. Ajouter 2 mL d’iPSC sur le coverslip pré-déposé dans le puits décrit à la section 1. Induction des iPSCs au NMJ Le jour 1, 24 h après l’ensemencement des iPSC dans la plaque de 6 puits, retirez le milieu de culture et remplacez-le par 2 mL de milieu cellulaire ES primate frais contenant 1 μg/mL de doxycycline à chaque puits. Changer le milieu avec 2 mL de milieu de différenciation myogénique (MDM) (Tableau 1) contenant 1 μg/mL de doxycycline (concentration finale) à chaque puits. Rafraîchissez le milieu tous les jours du jour 2 au jour 10. À partir du jour 11, passez du milieu à 2 mL de NMJ moyen(tableau 1)à chaque puits. Rafraîchissez le milieu tous les 3\u20124 jours après jusqu’au jour 30. Observez la NMJ différenciée par microscopie inversée par phase le jour 30. Le NMJ peut être utilisé pour l’analyse suivante. 3. Coloration de l’immunofluorescence (IF) Le jour 30, aspirez le milieu culturel de la plaque de 6 puits. Fixer la culture NMJ en ajoutant 2 mL de 4% de paraformaldéhyde à chaque puits pendant 30 min à température ambiante. Lavez les échantillons 3 fois en ajoutant 2 mL de 1x PBS à chaque puits (3 min pour chaque lavage). Perméabilize les échantillons avec 0,1% Triton /PBS pendant 10 min. Répétez l’étape 3.2. Bloquer les échantillons avec 0,5% BSA pour 1 h à température ambiante. Répétez l’étape 3.2. Incuber les échantillons avec les anticorps primaires à 4 °C pendant la nuit. La dilution des anticorps est la suivante : îlot 1 (1 μg/mL), chaîne lourde de myosine (MYH) (1/300), neurofilaments (NF) (1 μg S-100 (1/300), protéine vésicule synaptique 2 (SV2) (1 μg/mL), Tuj1 (1/1000). Répétez l’étape 3.2. Incuber les échantillons avec les anticorps secondaires à température ambiante pendant 1 h. La concentration des anticorps secondaires utilisés est la suivante : anti-souris IgG 488 conjugué (0,1 μg/mL), anti-lapin IgG 488 conjugué (0,1 μg/mL). Répétez l’étape 3.2. Incuber les échantillons avec un ABTX-647 (0,5 μg/mL) pour la coloration AChR et avec dapi (1 μg/mL) pour la coloration du noyau. Répétez l’étape 3.2. Ramassez le coverslip avec une paire de forceps de la plaque de 6 puits et montez-le dans la solution de glycérol/PBS de 50% sur une glissière de microscope. 4. Numérisation de la microscopie électronique (SEM) Fixer la culture NMJ avec 4% de paraformaldéhyde et 1% de glutaraldehyde préparé en tampon de phosphate de potassium de 0,1 M à température ambiante pendant 1 h. Lavez les échantillons 3 fois en les immergeant dans un tampon de phosphate de potassium de 0,1 M à température ambiante (10 min pour chaque lavage). Déshydrater les échantillons avec des concentrations croissantes d’éthanol (50%, 70%, 90%, 95% et 100% deux fois). Plonger les échantillons dans chaque concentration d’éthanol pendant 10 min. Séchez les échantillons à l’eau par un séchoir à point critique (-30 °C, 0,1 Torr). Enduire les échantillons d’ion pt (platine) (30 mA pendant 3 min; l’épaisseur de Pt est d’environ 20 nm). Observez les échantillons par SEM à 5 kV. 5. Microscopie électronique de transmission (TEM) Utilisez un grattoir cellulaire pour récolter les tissus de la plaque de culture NMJ. Façonner le tissu en une petite pastille (3 mm3) à l’aided’une lame de rasoir et coller par gelation pour former un morceau enveloppé de gel. Fixez le morceau enveloppé de gel avec 2% de paraformaldéhyde et 2% de glutaraldehyde préparé dans un tampon de phosphate de potassium de 0,1 M à 4 °C pendant la nuit. Lavez les échantillons 3 fois en les immergeant dans un tampon de phosphate de potassium de 0,1 M (15 min pour chaque lavage) à température ambiante. Postfix les échantillons avec 1% de tétoxyde d’osmium préparé en double distillé H2O pendant 1 h à température ambiante.ATTENTION: Cette étape doit être faite dans une hotte chimique. Répétez l’étape 5.2. Déshydrater les échantillons avec des concentrations croissantes d’éthanol (50%, 70%, 90%, 95% et 100% deux fois). Plonger les échantillons dans chaque concentration d’éthanol pendant 10 min. Aspirer l’éthanol à 100 %. Infiltrer les échantillons avec des rapports de volume croissants de résine époxy à 100% mélanges d’éthanol (1:3, 1:1 et 3:1). Agiter doucement chaque mélange à 10 rpm pendant 1 h à température ambiante. Remplacer le mélange époxy-éthanol par de la résine époxy pure et agiter doucement à 10 rpm pendant 4 h à température ambiante. Après 4 h, rafraîchir la résine époxy avec de la résine époxy fraîche et agiter doucement à 10 rpm pendant la nuit à température ambiante. Intégrer les échantillons dans des capsules d’intégration avec de la résine époxy fraîche et guérir les échantillons dans un four à 65 °C pendant la nuit. Ultramicrotomie Coupez grossièrement les blocs d’échantillon sous un microscope disséquant pour l’orientation correcte. Coupez finement les blocs grossièrement taillés à l’aide d’un couteau en verre sur un ultramicrotome pour obtenir des surfaces lisses. Préparer des sections ultrathin de 70 nm à partir des blocs bien taillés à l’aide d’un couteau à diamants. Récupérez les sections ultrathin avec 200 grilles de cuivre enduites de carbone en maille. Tacher les sections ultrathin contenant des grilles d’acétate d’uranyle saturé préparé en H2O distillé double pendant 30 min et laver les grilles 3 fois avec du H2O distillé double (10 min pour chaque lavage). De plus, comparez les sections ultrathin avec le citrate de plomb19 de Reynold (2,5 %) pendant 5 min et laver avec du H2O bouilli pré-refroidi à température ambiante 3 fois (10 min pour chaque lavage). Placez plusieurs granulés d’hydroxyde de sodium autour de la zone de coloration pour éviter les précipitations de CO2 sur les sections. Observez les sections ultrathin par TEM à 70 kV. 6. Contraction musculaire et traitement curare Pour déclencher la contraction du myotube, ajouter 25 mM CaCl2 dans le milieu culturel à l’étape 2.3. Le mouvement des myotubes peut être observé en 1\u20122 min. Placez la plaque de 6 puits sur la scène d’un microscope inversé. Enregistrez un film de contraction myotube par microscopie cellulaire en direct. Pour arrêter la contraction du myotube, ajouter du curare au milieu de culture (300 ng/mL). Ensuite, enregistrez le film comme étape 6.2. Ouvrez le fichier de film avec le logiciel d’analyse de vecteur de mouvement puis cliquez sur le bouton d’analyse de mouvement pour analyser le film.REMARQUE : La contraction des myotubes s’affiche sous forme de graphique en mouvement du temps. Les films sont codés en couleur pour montrer la vitesse de déplacement des myotubes. Les signaux scintilleux codés en couleur indiquent les mouvements des myotubes où la couleur rouge montre la vitesse de déplacement la plus rapide et la couleur bleue montre la vitesse de déplacement la plus lente.

Representative Results

En utilisant notre stratégie de différenciation, la culture a montré des composants pré et post-synaptiques du NMJ le jour 30. Les composants NMJ ont été induits et bien développés dans un seul puits, et leur morphologie et leurs emplacements dans le NMJ ont été démontrés par la microscopie IF (Figure 1). Le diagramme de flux de la figure 1A résume le cours du temps de la progression de différenciation du NMJ. La coloration des neurofilaments (NF), des vésicules synaptiques (SV2) et de l’AChR(figure 1B,C)indiquent les neurones. Les images de coloration unique de NF et SV2 sont affichées dans la figure supplémentaire 1. La coloration alpha-bungarotoxine indique AChR (Figure 1C). L’image fusionnée montre les emplacements relatifs d’un neurone moteur et de l’AChR dans le NMJ (Figure 1D,E). La deuxième série de colorations IF indique le neurone moteur par Tuj1 et l’îlot 1 (Figure 1G,H) et myotubes post-synaptiques par la chaîne lourde myosine (Figure 1I). Les cellules de Schwann ont également été étiquetées par anticorps S-100 dans la culture NMJ (Figure supplémentaire 2). Pour confirmer davantage l’identité des composants NMJ, nous avons utilisé SEM pour une analyse morphologique détaillée. La morphologie mature de NMJ avec les terminaux élargis d’axon, les axones et les fibres musculaires sont montrées dans la figure 2A,B. TEM a été exécuté pour révéler l’ultrastructure mûre des composants de NMJ comprenant le terminal pré-synaptique d’axon avec des vésicules synaptiques et la partie post-synaptique, qui est séparée par la fente synaptique (figure 2C\u2012E). Les plis jonctionnels sont indiqués par la ligne pointillée jaune, qui marque la jonction du neurone et des fibres musculaires (Figure 2C). Les terminaux d’axons matures qui contiennent des vésicules synaptiques sont indiqués dans la figure 2D,E (flèches jaunes). Les résultats morphologiques montrent que les composants NMJ ont été bien induits et mûris. Pour évaluer la fonction du NMJ in vitro, nous avons effectué l’analyse de mouvement en stimulant le neurone moteur avec CaCl2 pour déclencher des contractions de myotube. Les résultats ont montré que Ca2+ peut déclencher des contractions musculaires. Les contractions pourraient être interrompues par le curare. Le NMJ a montré des signaux de mouvement proéminents qui ont disparu avec le traitement de curare( figure 3). Cet effet confirme que les signaux des neurones moteurs ont été transmis par le NMJ pour déclencher la contraction musculaire. Prises dans leur ensemble, les données if microscopie, SEM et TEM ont démontré la distribution spatiale, la morphologie et la maturité des composants NMJ dans le NMJ in vitro généré par le protocole décrit ci-dessus. L’analyse de mouvement a validé la fonction du NMJ in vitro, ce qui implique son application potentielle au développement de stratégies thérapeutiques. Figure 1 : Diagramme de flux pour l’induction de NMJ et if images de la culture de NMJ. (A) Un diagramme de flux pour la progression de différenciation NMJ. (B\u2012F) Détection des composants NMJ, des neurofilaments (NF), des vésicules synaptiques (SV2) et de l’AChR. Les flèches blanches du panneau D indiquent le NMJ. (G\u2012K) Composants pré et post-synaptiques du NMJ. Tuj1 et Islet1 indiquent le neurone moteur, et la chaîne lourde de myosine (MYH) indique le myotube. a-BTX, alpha-bungarotoxin. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Images SEM et TEM de NMJ mature. (A) La distribution spatiale des composants NMJ montrent le terminal axon ancré à la surface de la fibre musculaire (Mf). (B) Un grossissement plus élevé du NMJ montre les terminaux d’axon. (C) L’ultrastructure d’un NMJ mature avec terminal d’axon pré-synaptique (pointes de flèches rouges) et vésicules synaptiques (Sv), fente synaptique (Sc) et parties post-synaptiques (flèches rouges). Les plis jonctionnels (jf) sont indiqués par la ligne jaune pointillée. Hache, axon. (D, E) Les images de grossissement élevé montrent les vésicules synaptiques dans les terminaux d’axon (flèches jaunes). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Analyse de contraction des myotubes du NMJ in vitro. La contraction des myotubes a été déclenchée avec la solution CaCl2 de 25 mM (ligne verte). Les contractions ont été inhibées après traitement avec le curare (ligne jaune). S’il vous plaît également voir Film supplémentaire 1 et Film supplémentaire 2. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Film supplémentaire 1: La contraction des myotubes déclenchée par Ca++. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo. Film supplémentaire 2: La contraction beaucoup plus faible des myotubes après le traitement curare est montré. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo. Figure supplémentaire 1 : Les images de coloration unique des neurofilaments (FN, flèches blanches) dans la culture du NMJ. Les images de coloration unique des vésicules synaptiques (SV2, flèches blanches) dans la culture NMJ. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre. Figure supplémentaire 2 : Les cellules de Schwann étiquetées par anticorps S-100 dans la culture NMJ. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre. Milieu de différenciation myogénique (MDM) MEM-alpha 500mL 100mM 2-ME 1117μL Doxycycline 1μg/mL Ksr 56mL (finale à 10%) Stylo/Strep 2,5 mL Total 560mL 100mM 2-mercaptoéthanol 2-mercaptoéthanol 7μL (7μL) d.d. eau 993μL (993μL) Total 1000μL NMJ moyen Milieu neurobasal (NB) 500mL B27 (en) 1x (stock en 50x) Bdnf 10ng/mL GDNF (GDNF) 10ng/mL N2 (N2) 1x (stock en 100x) NT3 (NT3) 10ng/mL Stylo/Strep 2,5 mL Tableau 1 : Formule moyenne.

Discussion

Des études antérieures ont rapporté des méthodes pour la formation de NMJ in vitro avec des méthodes sophistiquées qui exigent la culture à longterme 8,10,12,13,20. Ces réalisations mènent à la progression du NMJ in vitro. Toutefois, les méthodologies complexes ont entravé l’accès aux études du MNJ. Notre protocole évite la co-culture pour générer des NMJ efficacement et robustement dans un seul puits. Trois types de cellules dans le NMJ ont été observés dans notre système d’induction, y compris les myotubes, les neurones moteurs et les cellules de Schwann18. En outre, la morphologie et la fonction mûres ont été vérifiées.

Basé sur notre étude précédente, la densité initiale de cellules est un facteur critique pour la formation de NMJ, et différentes densités cellulaires induisent divers nombres de NMJ dans la culture18. Une faible densité cellulaire (< 1 x 104/cm2)induit un faible nombre de neurones, ce qui est défavorable à la formation de NMJ. Bien qu’il faudrait beaucoup plus de temps et de ressources pour préparer une densité plus élevée de cellules (> 1 x 105/cm2),nous recommandons que la densité cellulaire soit comprise entre 1,5 x 104/cm2 et 5 x 104/cm2 en utilisant notre protocole. Le NMJ généré par ce protocole est un tissu hétérogène avec plusieurs types de cellules qui est plus proche d’imiter les conditions physiologiques. Les myotubes sont trouvés à distribuer uniformément sur un plat de culture, mais les neurones moteurs apparaissent au hasard, dont le phénomène se traduit par la distribution inégale des NMJ dans une culture. Ce NMJ convient aux études qualitatives au lieu de l’analyse nécessitant des systèmes de culture homogènes. Nous avons également utilisé d’autres lignées cellulaires, eq., H9 (ligne cellulaire ES)18 et A11 (ligne cellulaire iPS, données non montrées) pour générer NMJ par ce protocole. Le NMJ peut être généré avec succès dans la morphologie et la fonction. La condition de culture, néanmoins, doit être optimisée pour différentes lignées cellulaires.

La contraction chimiquement déclenchée de myotubes et l’inhibition curare-dépendante ont confirmé que notre NMJ in vitro était fonctionnel et pourrait être potentiellement appliqué pour des analyses pratiques. Des contractions spontanées de muscle ont été observées aléatoirement à 3\u20124 semaines de culture, mais il pourrait être évité en prolongeant le temps de culture jusqu’à deux mois18.

Diverses stratégies ont été publiées pour générer in vitro NMJ de différents stades de maturation, mais le NMJ in vitro généré dans notre système a montré la maturité significative, comme nous pouvons observer la transition du gamma vers les sous-unités epsilon de l’AChR au cours de la culture18. La maturité est une considération importante pour la modélisation de la maladie avec in vitro NMJ21. En conclusion, un NMJ in vitro avec des composants structurels intégrés, la maturité et la fonction est d’une utilité potentielle pour le développement thérapeutique.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Sakurai d’avoir gentiment fourni 201B7MYOD. L’étude sur la microscopie électronique a été soutenue par Keiko Okamoto-Furuta et Haruyasu Kohda (Division of Electron Microscopic Study, Center for Anatomique Studies, Graduate School of Medicine, Université de Kyoto). L’anticorps monoclonal a été développé par l’Université HHMI/Columbia, obtenu auprès de la Developmental Studies Hybridoma Bank, créée par le National Institute Child Health and Human Development of the NIH, et maintenue au Département de biologie de l’Université de l’Iowa. Nous remercions également Shiori Oshima, Kazuhiro Nakagawa et Eriko Matsui pour l’analyse des vecteurs de mouvement. Ces travaux ont été soutenus par le financement de la Société japonaise pour la promotion de la science KAKENHI, les numéros de subvention 16H05352 et 20H03642 (à MKS); fonds de recherche sur les cellules iPS (à CYL et MKS); Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research (à MKS); Takeda Science Foundation (à MKS); et une subvention du Programme de recherche sur les maladies insolubles utilisant des cellules iPS spécifiques aux maladies, qui a été aidée par l’Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (17935400 à CYL et MKS, et 17935423 à MKS).

Materials

Medium, growth factors and reagents Item Brand Cat. Number
2-mercaptoethanol Nacalai tesque 21418-42
B27, Gibco Gibco 12587-001
BDNF R & D Systems 248-BD
Cell detachment solution, Accumax STEMCELL Technologies #07921
Critical point dryer Hitachi ES-2030
Doxycycline Takara 631311
ECM, Matrigel (growth factor reduced) Corning 356230
GDNF R & D Systems 212-GD
Gelation, IP gel Geno Staff PG20-1
Ions coater JEOL JEC3000FC
iPSC medium, mTeSR STEMCELL Technologies 85850
KnockOut SR (KSR) Gibco 10828-028
live cell microscopy Nikon Eclipse Ti microscope
MEM-alpha Gibco 12571-071
Motion vector analysis software Sony SI8000
N2, Gibco Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103-049
NT3 R & D Systems 267-N3
Primate ES cell medium ReproCell RCHEMD001
SEM Hitachi S-4700
TEM Hitachi H7650
Y27632 Wako Chemicals GmbH 253-00513
Antibodies Brand Cat. Number Dilutions
Molecular Probes B3545 0.5 ug/ml
Islet 1 DSHB 40.2D6 1/100
Myosin heavy chain (MYH) MilliporeSigma A4.1025 1/300
Neurofilaments (NF) MilliporeSigma MAB5254 1/500
S-100 Abcam ab14849 1/300
Synaptic vesicle protein 2 (SV2) DSHB SV2 1/50
Tuj1 Covance MMS435P 1/1000
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References

  1. Hong, I. H. K., Etherington, S. J. Neuromuscular Junction. eLS. , (2001).
  2. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
  3. Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  4. Slater, C. R. The Structure of Human Neuromuscular Junctions: Some Unanswered Molecular Questions. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2183 (2017).
  5. Comley, L. H., Nijssen, J., Frost-Nylen, J., Hedlund, E. Cross-disease comparison of amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy reveals conservation of selective vulnerability but differential neuromuscular junction pathology. Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1424-1442 (2016).
  6. Shigemoto, K., et al. Muscle weakness and neuromuscular junctions in aging and disease. Geriatrics & Gerontology International. 10, 137-147 (2010).
  7. Abicht, A., Müller, J., Lochmüller, H. Congenital Myasthenic Syndromes. GeneReviews. , (2016).
  8. Faravelli, I., et al. Motor neuron derivation from human embryonic and induced pluripotent stem cells: experimental approaches and clinical perspectives. Stem Cell Research & Therapy. 5 (4), 87-100 (2014).
  9. Demestre, M., et al. Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes. Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).
  10. Yoshida, M., et al. Modeling the early phenotype at the neuromuscular junction of spinal muscular atrophy using patient-derived iPSCs. Stem Cell Reports. 4 (4), 561-568 (2015).
  11. Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. A system for studying mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance. Development. 143 (13), 2464-2477 (2016).
  12. Uzel, S. G. M., et al. Microfluidic device for the formation of optically excitable, three-dimensional, compartmentalized motor units. Science Advances. 2 (8), 1501429 (2016).
  13. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  14. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
  15. Tanaka, A., et al. Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro. PLoS One. 8 (4), 61540 (2013).
  16. Furlan, A., Adameyko, I. Schwann cell precursor: a neural crest cell in disguise. Developmental Biology. 444, 25-35 (2018).
  17. Jessen, K. R., Mirsky, R. Schwann Cell Precursors; Multipotent Glial Cells in Embryonic Nerves. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12 (69), (2019).
  18. Lin, C. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2019).
  19. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
  20. Steinbeck, J. A., et al. Functional Connectivity under Optogenetic Control Allows Modeling of Human Neuromuscular Disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  21. Bucchia, M., Merwin, S. J., Re, D. B., Kariya, S. Limitations and Challenges in Modeling Diseases Involving Spinal Motor Neuron Degeneration in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 61 (2018).

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Lin, C., Yoshida, M., Li, L., Saito, M. K. In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (166), e61396, doi:10.3791/61396 (2020).
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