ヒト人工多能性幹細胞から誘導されるインビトロ神経筋接合

1. 細胞外マトリックス(ECM)コーティングプレートの調製 氷冷1x PBSを2%の最終濃度に希釈ECM( 材料表を参照) 50 mL プラスチックチューブに1x PBSの49 mLにECMの1 mLを加えます。何度か上下にピペットを入れ、よく混ぜます。 6ウェルプレートの各ウェルに1つのカバースリップを入れる。各ウェルに2Mの1.5 mLを加えます。 ウェルプレートを2Mで2時間37°Cでインキュベートします。 ウェルプレートからECMを吸引し、使用前に4°Cで保管してください。 2. NMJに対するiPSCの差別化 セクション1で準備された6ウェルプレートの井戸当たり4 x 105 のiPSC。ウェルにあらかじめ堆積したカバースリップの細胞を播種してください。注:この研究では、201B7MYOD iPS細胞株、桜井博士の研究室からの贈り物は、15を使用しました。 6cm培養皿のiPSCから培地を取り出し、1x PBSでiPSCを1回洗います。 1 mLの細胞剥離液を皿に加え、37°Cで10分間インキュベートします。 3 mLの霊長類胚茎(ES)細胞培地を皿に加え、ピペットを3回軽く加えます。 取り外しされたiPSCを含む上清を50mLのプラスチックチューブに集め、4°Cで160×gの遠心分離機を5分間回収します。 g 上清を慎重に吸引し、iPSCを10μM Y27632で3mL霊長類ES細胞培地に再懸濁し、ヘミック計を用いて細胞数をカウントする。 霊長類ES細胞培地と10 μM Y27632でiPSCを2 x 105 細胞/mLの濃度に希釈します。セクション1に記載されているウェルにあらかじめ堆積したカバースリップに2mLのiPSCを追加します。 NMJへのiPSCの誘導 iPSCを6ウェルプレートに播種した1日目、24時間、培養培地を取り除き、各ウェルに1μg/mLのドキシサイクリンを含む新鮮な霊長類ES細胞培地2mLに交換します。 1 μg/mLドキシサイクリン(最終濃度)を含有する2mLの筋形成分化培地(MDM)(表1)を各ウェルに交換します。毎日 2 日目から 10 日目までメディアを更新します。 11日目から、培地をNMJ培地(表1)の2mLに各ウェルに切り替えます。3\u20124 日ごとにメディアを更新してから 30 日目まで更新します。 30日目に相反転顕微鏡で分化されたNMJを観察します。NMJは、以下の分析に使用できます。 3. 免疫蛍光(IF)染色 30日目に、培養液を6ウェルプレートから吸引する。室温で30分間、4%パラホルムアルデヒドを2mLずつウェルウェルに加えてNMJ培養を修正します。 各ウェルに2mLの1xPBSを加えてサンプルを3回洗浄します(各洗浄ごとに3分)。 0.1%トリトン/PBSで10分間透過します。 ステップ 3.2 を繰り返します。 室温で1時間0.5%BSAでサンプルをブロックします。 ステップ 3.2 を繰り返します。 一次抗体を一晩4°Cでインキュベートします。抗体の希釈は次のとおりです: 膵虫1(1 μg/mL),ミオシン重鎖(MYH)(1/300)、神経フィラメント(NF)(1 μg/mL)、S-100(1/300)、シナプス小胞タンパク質2(SV2)(1μg/mL)、Tuj11L ステップ 3.2 を繰り返します。 2次抗体を室温で1時間インキュベートします。使用する二次抗体の濃度は以下の通りです:抗マウスIgG 488コンジュゲート(0.1 μg/mL)、抗ウサギIgG 488コンジュゲート(0.1 μg/mL)です。 ステップ 3.2 を繰り返します。 AChR染色用のaBTX-647(0.5 μg/mL)と核染色用のDAPI(1 μg/mL)でサンプルをインキュベートします。 ステップ 3.2 を繰り返します。 6ウェルプレートから鉗子のペアでカバースリップをピックアップし、顕微鏡スライド上の50%グリセロール/PBS溶液に取り付けます。 4. 走査型電子顕微鏡(SEM) 室温で0.1 Mリン酸カリウムバッファーに調製した4%パラホルムアルデヒドと1%グルタルアルデヒドを1時間でNMJ培養を修正します。 試料を0.1Mリン酸カリウムバッファーに室温(洗浄ごとに10分)に浸漬して3回洗浄します。 エタノールの上昇濃度(50%、70%、90%、95%、100%2回)でサンプルを脱水します。エタノールの各濃度にサンプルを10分間浸漬します。 臨界点乾燥機(-30°C、0.1 Torr)でサンプルを乾燥させます。 サンプルをPt(プラチナ)イオンコーター(30mAで3分間、Ptの厚さは約20nm)でコーティングします。 5 kVでSEMでサンプルを観察してください。 5. 透過型電子顕微鏡(TEM) NMJ培養プレートから組織を収穫するために細胞スクレーパーを使用してください。組織を小さなペレット(3mm3)に小さなペレットに形成し、カミソリの刃で接着し、ゲル包装された部分を形成します。ゲル包装片を2%パラホルムアルデヒドと2%グルタルアルデヒドで固定し、0.1 Mリン酸カリウムバッファーで一晩で4°Cで調製したグルタルアルデヒドを固定します。 試料を0.1Mリン酸バッファー(洗浄ごとに15分)に室温で浸漬して3回洗浄します。 試料を1%オスミウム四酸化窒素で1時間分の2蒸留H2Oで室温で後置する。注意:このステップは、化学フードで行う必要があります。 ステップ 5.2 を繰り返します。 エタノールの上昇濃度(50%、70%、90%、95%、100%2回)でサンプルを脱水します。エタノールの各濃度にサンプルを10分間浸漬します。 100%エタノールを吸引する。エポキシ樹脂の上昇体積比を100%エタノール混合物(1:3、1:1および3:1)でサンプルに浸潤します。各混合物を室温で1時間10rpmで穏やかに攪拌する。 エポキシエタノール混合物を純粋なエポキシ樹脂に置き換え、室温で10rpmでゆっくり攪拌します。 4時間後、エポキシ樹脂をフレッシュエポキシ樹脂でリフレッシュし、室温で10rpmで穏やかに攪拌します。 新鮮なエポキシ樹脂と埋め込みカプセルにサンプルを埋め込み、一晩で65°Cでオーブンでサンプルを硬化させます。 超音波顕微鏡 サンプルブロックを解剖顕微鏡で粗くトリミングし、正しい方向を取り付けます。 粗くトリミングされたブロックを超ミクロトームのガラスナイフで細かくトリミングし、滑らかな表面を得ます。 ダイヤモンドナイフでよくトリミングされたブロックから70 nmの超薄セクションを準備します。200メッシュカーボンフォームバーコーティング銅グリッドで超薄型セクションを取得します。 飽和ウラニル酢酸と格子を含む極薄切片を30分間二重蒸留H2Oで調製し、二重蒸留H2O(洗浄ごとに10分)でグリッドを3回洗浄します。 さらに、超薄いセクションをレイノルズのクエン酸鉛19(2.5%) と対比する5分間、ゆでたH2Oで室温3回(洗浄ごとに10分)に予熱して洗浄します。染色領域の周りにいくつかの水酸化ナトリウムペレットを入れて、切片上のCO2 沈殿を防ぎます。 70 kVで TEM で超薄セクションを観察します。 6. 筋肉収縮とキュア治療 筋管収縮を引き起こすために、ステップ2.3の培養培地に25mMCaCl2 を加える。ミオチューブの動きは1\u20122分で観察することができる。 6ウェルプレートを反転した顕微鏡のステージに置きます。ライブ細胞顕微鏡による筋管収縮の動画を記録する。 筋管収縮を止めるには、培養培地(300ng/mL)にキュレを加える。次に、ムービーをステップ 6.2 として録画します。 モーションベクトル解析ソフトウェアでムービーファイルを開き、「 モーション解析」 ボタンをクリックしてムービーを解析します。メモ:筋管収縮は、タイムモーショングラフィックとして表示されます。映画は、ミオチューブの動き速度を示すために色分けされています。色分けされたキラキラ信号は、赤い色が最も速い移動速度を示し、青色の色が最も遅い移動速度を示すmyotubesの動きを示します。