JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

In vitro Neuromusculaire Verbinding veroorzaakt uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen

Published: December 03, 2020
doi:
10.3791/61396
, , ,
1Department of Clinical Application, Center for iPS Cell Research and Application (CiRA),Kyoto University, 2Department of Pediatrics,Kyoto Prefectural University of Medicine, 3Graduate Institute of Clinical Medicine,Taipei Medical University

Summary

Hier bieden we een protocol om in vitro NMJs te genereren uit door de mens veroorzaakte pluripotente stamcellen (iPSC’s). Deze methode kan NMJs met volwassen morfologie en functie in 1 maand in een enkele put induceren. De resulterende NMJ’s kunnen mogelijk worden gebruikt om gerelateerde ziekten te modelleren, pathologische mechanismen te bestuderen of om geneesmiddelenverbindingen te screenen op therapie.

Abstract

De neuromusculaire verbinding (NMJ) is een gespecialiseerde synaps die actie potentials van het motorneuron naar skeletspier voor mechanische beweging verzendt. De architectuur van de NMJ-structuur beïnvloedt de functies van het neuron, de spier en de onderlinge interactie. Eerdere studies hebben gemeld veel strategieën door co-culturing de motorische neuronen en myobuizen om NMJ in vitro te genereren met complexe inductie proces en lange cultuur periode, maar hebben moeite om volwassen NMJ morfologie en functie recapituleren. Ons in vitro NMJ inductiesysteem is gebouwd door menselijke iPSC te differentiëren in één kweekgerecht. Door het myogene en neurogene inductiemedium te verwisselen voor inductie, bevatte de resulterende NMJ pre- en postsynaptische componenten, waaronder motorneuronen, skeletspieren en Schwanncellen in de een maandcultuur. De functionele test van NMJ toonde ook aan dat de myotubes contractie kan worden geactiveerd door Ca++ vervolgens geremd door curare, een acetylcholine receptor (AChR) remmer, waarbij het stimulerende signaal wordt overgedragen via NMJ. Deze eenvoudige en robuuste aanpak heeft de complexe structuur van NMJ met succes afgeleid met functionele connectiviteit. Deze in vitro menselijke NMJ, met zijn geïntegreerde structuren en functie, heeft veelbelovend potentieel voor het bestuderen van pathologische mechanismen en samengestelde screening.

Introduction

De neuromusculaire verbinding (NMJ) is een gespecialiseerde synaps die signalen van motorneuronen naar skeletspieren verzendt om vrijwillige spierbeweging1,2te controleren. Deze synaps bestaat uit pre- en post-synaptische onderdelen. In het presynaptische deel, de motorneuron releases acetylcholine (ACh) van synaptische vikjes door exocytose. ACh wordt vrijgegeven van synaptische vikjes om de synaptische kloof over te steken en te binden aan AChR op de post-synaptische deel om een actie potentieel voor spiercontractie3,4trigger . Elke storing in deze delicate structuur kan leiden tot NMJ ziekten, met inbegrip van spinale musculaire atrofie (SMA), aangeboren myasthenic syndromen (CMS), myasthenie gravis (MG)5,,6,,7, enz. Deze ziekten schaden de kwaliteit van het leven van patiënten sterk en hebben helaas geen effectieve behandelingsbenaderingen vanwege het gebrek aan inzicht in het pathologische mechanisme. In deze studie wilden we in vitro human NMJ genereren uit menselijke IPSCs voor nauwkeurige ziektemodellering en voor screening van therapeutische verbindingen.

Eerdere studies hebben aangetoond dat de mogelijkheid van het genereren van in vitro NMJ door co-cultuur strategieën. De motorneuronen en skelet myobuizen worden respectievelijk gegenereerd. De twee celtypen kunnen worden gegenereerd uit primaire weefselculturen voor mens of muis of worden opgewekt uit stamcellen8,,9,,10,,11 en vervolgens co-gekweekt voor NMJ-vorming. De andere toepassingen omvatten het samenvoegen van de co-gekweekte NMJ in microfluïde 3D-apparaten en het gebruik van optogenetische eenheden voor kwantificeerbare functionele tests12,13. Echter, deze strategieën nemen een lange cultuurperiode en vereisen strijd om de primaire componenten van de NMJ te verkrijgen, hetzij de motorische neuron of het skelet myotube tegelijkertijd. Nog een ander belangrijk onderdeel van NMJ, de Schwann-cel, kan niet worden gegenereerd in deze cultuursystemen. Het geavanceerde cultuursysteem dat de myobuis, motorneuron en Schwann cel bevat is wenselijk omdat het een betrouwbaar en robuust model voor NMJ-studies kan bieden.

Myogene Differentiatie 1 (MYOD1) is een bekende myogene regulator voor myogenese14. De efficiënte myogene differentiatiemethode die MYOD1 toepaste om iPSC in myotubes te drijven werd gebouwd in een vorige studie15. Daarom hebben we de myotubes geïnduceerd door MYOD1 in iPSC’s15te overspuiten, en een hoge efficiëntie van myogene differentiatie werd getoond. Interessant, neuron cellen verscheen samen met myotubes spontaan na dag 10. Het verschijnen van neuron cellen in myogene cultuur heeft ons ertoe gebracht om de strategie voor het genereren van in vitro NMJ in een enkel gerecht te ontwikkelen. Hier bieden we een strategie om NMJ’s te genereren door MYOD1 te overexpresseren in menselijke iPSC’s voor myogene en motorische neuron inductie in dezelfde cultuurschotel. De motorneuronen worden spontaan geïnduceerd met verschillende neurotrofe factoren (GDNF, BDNF, NT3, enz.) 8, en ondertussen kunnen de Schwann cellen ook worden geïnduceerd16,17. Door de interacties tussen de myobuizen, de motorische neuronen en de Schwann cellen, de volwassen NMJ worden gevormd18. Deze methode kan functionele NMJ efficiënt genereren, waardoor de potentiële studie van pathologische mechanismen en therapeutische samengestelde screening mogelijk wordt.

Protocol

1. Bereiding van extracellulaire matrixplaten (ECM)-gecoate platen Verdun ECM (zie tabel van materialen)met ijskoude 1x PBS tot een uiteindelijke concentratie van 2%. Voeg 1 mL ECM toe aan 49 mL van 1x PBS in een plastic buis van 50 mL. Meng goed door pipetting op en neer meerdere malen. Plaats 1 coverslip in elke put van een 6-well plaat. Voeg 1,5 mL van 2% ECM in elke put. Broed de putplaat met 2% ECM voor 2 uur bij 37 °C. Aspirate ECM uit de putplaat en bewaar de plaat voor gebruik op 4 °C. 2. Differentiatie van iPSCs ten opzichte van NMJ Zaad 4 x 105 van iPSCs per put op de 6-goed plaat bereid in sectie 1. Zorg ervoor dat de cellen zaad op de coverslip vooraf afgezet in de put.OPMERKING: In deze studie werd de 201B7MYOD iPS-cellijn, een geschenk van Dr. Sakurai’s Lab, gebruikt15. Verwijder het medium uit de iPSC’s op de 6 cm kweekschaal en was de iPSC’s één keer met 1x PBS. Voeg 1 mL cellossoplossing toe aan de schaal en broed gedurende 10 minuten bij 37 °C uit. Voeg 3 mL primate embryonale stam (ES) celmedium toe aan de schaal en pipet 3 keer voorzichtig. Verzamel de supernatant, die losse iPSCs bevat, in een 50 mL plastic buis en centrifuge bij 160 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten. Zuid voorzichtig aanzuigen, de iPSC’s opnieuw opschorten in 3 mL primaten ES-celmedium met 10 μM Y27632 en het celnummer tellen met behulp van een hemocytometer. Verdun de iPSC’s met primaten ES-celmedium en 10 μM Y27632 tot een concentratie van 2 x 105 cellen/mL. Voeg 2 mL iPSCs toe op de coverslip die vooraf is gedeponeerd in de put die in punt 1 wordt beschreven. Inductie van de iPSC’s naar NMJ Op dag 1, 24 uur na het zaaien van de iPSC’s op de 6-well plaat, verwijder het kweekmedium en vervang deze door 2 mL vers primaten ES-celmedium met 1 μg/mL doxycycline aan elke put. Verander het medium met 2 mL myogene differentiatiemedium (MDM) (Tabel 1) met 1 μg/mL doxycycline (uiteindelijke concentratie) in elke put. Vernieuw het medium elke dag van dag 2 tot dag 10. Schakel vanaf dag 11 het medium naar 2 mL NMJ-medium(tabel 1) naar elke put. Vernieuw het medium daarna elke 3\u20124 dagen daarna tot dag 30. Observeer de gedifferentieerde NMJ per fase omgekeerde microscopie op dag 30. De NMJ kan worden gebruikt voor de volgende analyse. 3. Immunofluorescentie (IF) kleuring Op dag 30, aspirate de cultuur medium van de 6-well plaat. Fix de NMJ cultuur door het toevoegen van 2 mL van 4% paraformaldehyde aan elke put voor 30 min bij kamertemperatuur. Was de monsters 3 keer door 2 mL van 1x PBS toe te voegen aan elke put (3 min voor elke wasbeurt). Doordring de monsters met 0,1% Triton/PBS gedurende 10 minuten. Herhaal stap 3.2. Blokkeer de monsters met 0,5% BSA voor 1 uur bij kamertemperatuur. Herhaal stap 3.2. Incubeer de monsters met de primaire antilichamen bij 4 °C ‘s nachts. De verdunning van antilichamen is als volgt: Eilandje 1 (1 μg/mL), myosine zware ketting (MYH) (1/300), neurofilamenten (NF) (1 μg/mL), S-100 (1/300), synaptisch blaasje eiwit 2 (SV2) (1 μg/mL), Tuj1 (1/1000). Herhaal stap 3.2. Incubeer de monsters met de secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. De concentratie van de gebruikte secundaire antilichamen is als volgt: antimuis IgG 488 vervoegd (0,1 μg/mL), anti-konijn IgG 488 vervoegd (0,1 μg/mL). Herhaal stap 3.2. Incubeer de monsters met aBTX-647 (0,5 μg/mL) voor AChR-kleuring en met DAPI (1 μg/mL) voor nucleus-vlekken. Herhaal stap 3.2. Pak de coverslip op met een tang van de 6-well plaat en monteer deze in 50% glycerol/PBS oplossing op een microscoopplaat. 4. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) Bevestig de NMJ-cultuur met 4% paraformaldehyde en 1% glutaraldehyde bereid in 0,1 M kaliumfosfaatbuffer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was de monsters 3 keer door ze onder te dompelen in 0,1 M kaliumfosfaatbuffer bij kamertemperatuur (10 min voor elke wasbeurt). Dehydrateer de monsters met opgaande concentraties ethanol (50%, 70%, 90%, 95% en 100% tweemaal). Dompel de monsters in elke concentratie ethanol gedurende 10 minuten onder. Droog de monsters met een kritische puntdroger (-30 °C, 0.1 Torr). Coat de samples met Pt (platina) ion coater (30 mA voor 3 min; dikte pt is ongeveer 20 nm). Let op de monsters van SEM op 5 kV. 5. Transmissieelektronenmicroscopie (TEM) Gebruik een celschraper om het weefsel van de NMJ-kweekplaat te oogsten. Vorm het weefsel in een kleine pellet (3 mm3) met een scheermesje en lijm door gelation om een gel-verpakt stuk te vormen. Bevestig het met gel omwikkelde stuk met 2% paraformaldehyde en 2% glutaraldehyde bereid in 0,1 M kaliumfosfaatbuffer bij 4 °C ‘s nachts. Was de monsters 3 keer door ze onder te dompelen in 0,1 M kaliumfosfaatbuffer (15 min voor elke wasbeurt) bij kamertemperatuur. Postfix de monsters met 1% osmiumtetroxide bereid in dubbel gedistilleerde H2O gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.LET OP: Deze stap moet worden gedaan in een chemische kap. Herhaal stap 5.2. Dehydrateer de monsters met opgaande concentraties ethanol (50%, 70%, 90%, 95% en 100% tweemaal). Dompel de monsters in elke concentratie ethanol gedurende 10 minuten onder. De 100% ethanol aanzuigen. Infiltreer de monsters met oplopende volumeverhoudingen van epoxy hars tot 100% ethanolmengsels (1:3, 1:1 en 3:1). Roer elk mengsel voorzichtig bij 10 tpm voor 1 uur bij kamertemperatuur. Vervang het epoxy-ethanolmengsel door zuivere epoxy hars en roer voorzichtig bij 10 tpm gedurende 4 uur bij kamertemperatuur. Na 4 uur vernieuw je de epoxy hars met verse epoxy hars en roer je zachtjes zachtjes bij 10 rpm ‘s nachts bij kamertemperatuur. Sluit de monsters in het inbedden van capsules met verse epoxy hars en genees de monsters in een oven op 65 °C ‘s nachts. Ultramicrotomie Snijd de monsterblokken grof bij onder een ontledenmicroscoop voor de juiste oriëntatie. Snijd de grof bijgesneden blokken fijn met een glazen mes op een ultramicrotome om gladde oppervlakken te verkrijgen. Bereid 70 nm ultradunne secties uit de goed bijgesneden blokken met een diamantmes. Haal de ultradunne secties met 200 mesh carbon-formvar-gecoate koperen roosters. Bevlek de ultradunne secties met roosters met verzadigd uranylacetaat bereid in dubbel gedistilleerde H2O gedurende 30 minuten en was de roosters 3 keer met dubbel gedistilleerde H2O (10 min voor elke wasbeurt). Verder contrasteert u de ultradunne secties met Reynold’s lead citrate19 (2,5%) voor 5 min en wassen met gekookte H2O voorgekoeld tot kamertemperatuur 3 keer (10 min voor elke wasbeurt). Plaats verschillende natriumhydroxidekorrels rond het kleurgebied om CO2-neerslag op de secties te voorkomen. Bekijk de ultradunne secties van TEM op 70 kV. 6. Spiercontractie en curare behandeling Om de myotube contractie te activeren, voeg 25 mM CaCl2 in het cultuurmedium in stap 2.3 toe. De beweging van myotubes kan worden waargenomen in 1\u20122 min. Plaats de 6-well plaat op het podium van een omgekeerde microscoop. Neem een film van myotube contractie door live cel microscopie. Om de myotube contractie te stoppen, voeg curare toe aan het cultuurmedium (300 ng/mL). Neem de film dan op als stap 6.2. Open het filmbestand met bewegingsvectoranalysesoftware en klik vervolgens op de knop Bewegingsanalyse om de film te analyseren.OPMERKING: De myotubes contractie wordt weergegeven als time-motion afbeelding. De films zijn kleurgecodeerd om de bewegingssnelheid van myotubes te tonen. De kleurgecodeerde sprankelende signalen geven de bewegingen van myotubes aan waar de rode kleur de snelste bewegingssnelheid en blauwe kleur toont de langzaamste bewegingssnelheid.

Representative Results

Met behulp van onze differentiatiestrategie toonde de cultuur pre- en post-synaptische componenten van de NMJ op dag 30. De NMJ componenten werden geïnduceerd en goed ontwikkeld in een enkele put, en hun morfologie en locaties in de NMJ werden aangetoond door IF microscopie (Figuur 1). Het stroomdiagram in figuur 1A geeft een overzicht van het verloop van de NMJ-differentiatieprogressie. De kleuring van neurofilamenten (NF), synaptische vesikels (SV2) en AChR (figuur 1B,C)geven de neuronen aan. De enkelvoudige kleuringsafbeeldingen van NF en SV2 zijn te zien in aanvullende figuur 1. De alfa-bungarotoxine kleuring geeft AChR(figuur 1C) aan. De samengevoegde afbeelding toont de relatieve locaties van een motorneuron en AChR in de NMJ (figuur 1D,E). De tweede set IF-kleuring geeft het motorneuron van Tuj1 en Islet 1(figuur 1G,H) en post-synaptische myotubes door myosine zware ketting(figuur 1I). De Schwann cellen werden ook gelabeld door S-100 antilichaam in de NMJ cultuur (Aanvullende figuur 2). Om de identiteit van de NMJ-componenten verder te bevestigen, gebruikten we SEM voor gedetailleerde morfologische analyse. Volwassen NMJ morfologie met uitgebreide axon terminals, axonen en spiervezels worden weergegeven in figuur 2A,B. TEM werd uitgevoerd om de volwassen ultrastructuur van de NMJ componenten te onthullen, waaronder de pre-synaptische axon terminal met synaptische vijlen en het post-synaptische deel, dat wordt gescheiden door de synaptische kloof(Figuur 2C\u2012E). Junctionele plooien worden aangegeven door de gele stippellijn, die de kruising van het neuron en spiervezels markeert (figuur 2C). De volwassen axonterminals die synaptische vikjes bevatten, worden weergegeven in figuur 2D,E (gele pijlen). De morfologische resultaten tonen aan dat de NMJ componenten goed werden geïnduceerd en gerijpt. Om de functie van de in vitro NMJ te evalueren, voerden we bewegingsanalyse uit door het motorneuron te stimuleren met CaCl2 om myotube-samentrekkingen te activeren. De resultaten toonden aan dat Ca2 + kan leiden tot spiercontracties. De weeën kunnen worden onderbroken door curare. De NMJ toonde prominente bewegingssignalen die verdwenen met curare behandeling (figuur 3). Dit effect bevestigt dat de motorneuron signalen werden overgedragen via de NMJ om spiercontractie te activeren. Samen toonden de IF-microscopie, SEM en TEM-gegevens de ruimtelijke verdeling, morfologie en rijpheid van de NMJ-componenten aan in de in vitro NMJ gegenereerd door het hierboven beschreven protocol. Bewegingsanalyse valideerde de functie van de in vitro NMJ, wat de mogelijke toepassing ervan op het ontwikkelen van therapeutische strategieën impliceert. Figuur 1: Stroomgrafiek voor NMJ-inductie en IF-beelden van de NMJ-cultuur. (A) Een stroomdiagram voor de nmj-differentiatieprogressie. (B\u2012F) Detectie van NMJ-componenten, neurofilamenten (NF), synaptische vesikels (SV2) en AChR. De witte pijlen in paneel D geven de NMJ aan. (G\u2012K) Pre- en post-synaptische componenten van de NMJ. Tuj1 en Islet1 geven het motorneuron aan, en myosine zware ketting (MYH) geeft de myotube aan. a-BTX, alfa-bungarotoxine. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: SEM- en TEM-afbeeldingen van volwassen NMJ. (A) De ruimtelijke verdeling van NMJ-componenten toont de axonterminal die verankerd is op het oppervlak van de spiervezel (Mf). (B) Een hogere vergroting van de NMJ toont de axonterminals. (C) De ultrastructuur van een gerijpte NMJ met pre-synaptische axonterminal (rode pijlpunten) en synaptische vijlen (Sv), synaptische spleet (Sc) en postsynaptische delen (rode pijlen). Junctional folds (jf) worden aangegeven door de gele stippellijn. Bijl, axon. (D, E) De hoge vergrotingsbeelden tonen de synaptische vikjes in axonterminals (gele pijlen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: Myotubes contractie analyse van in vitro NMJ. Myotubes contractie werden geactiveerd met 25 mM CaCl2 oplossing (groene lijn). De weeën werden geremd na behandeling met curare (gele lijn). Zie ook Aanvullende Film 1 en Aanvullende Film 2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Aanvullende Film 1: De myotubes contractie veroorzaakt door Ca++. Klik hier om deze video te downloaden. Aanvullende Movie 2: De veel zwakkere samentrekking van myotubes na curare behandeling wordt getoond. Klik hier om deze video te downloaden. Aanvullende figuur 1: De enkele kleuringsbeelden van neurofilamenten (NF, witte pijlen) in de NMJ-cultuur. De enkele kleuring beelden van synaptische vikjes (SV2, witte pijlen) in NMJ cultuur. Klik hier om dit cijfer te downloaden. Aanvullende figuur 2: De Schwann cellen gelabeld door S-100 antilichaam in NMJ cultuur. Klik hier om dit cijfer te downloaden. Myogene differentiatiemedium (MDM) MEM-alpha 500mL 100mM 2-ME 1117μL Doxycycline 1μg/mL Ksr 56mL (definitief tot 10%) Pen/Strep 2,5 mL Totale 560mL 100mM 2-mercaptoethanol 2-mercaptoethanol 7μL d.d. 993μL Totale 1000μL NMJ medium Neurobasaal medium (NB) 500mL B27 1x (voorraad in 50x) BDNF (BDNF) 10ng/mL GDNF (GDNF) 10ng/mL N2 1x (voorraad in 100x) NT3 10ng/mL Pen/Strep 2,5 mL Tabel 1: Formule van medium.

Discussion

Eerdere studies hebben methoden voor NMJ-vorming in vitro gemeld met geavanceerde methoden die een langdurige cultuurvereisen 8,10,12,13,20. Deze prestaties leiden de progressie van in vitro NMJ. De ingewikkelde methodologieën belemmerden echter de toegang tot NMJ-studies. Ons protocol vermijdt co-cultuur om NMJ’s efficiënt en robuust te genereren in één put. Drie celtypes in de NMJ werden waargenomen in ons inductiesysteem, waaronder de myobuizen, de motorneuronen en de Schwann cellen18. Daarnaast werden volwassen morfologie en functie geverifieerd.

Op basis van onze vorige studie, de initiële celdichtheid is een kritische factor voor NMJ vorming, en verschillende celdichtheden induceren verschillende aantallen NMJs in de cultuur18. Een lage celdichtheid (< 1 x 104/cm2)veroorzaakte een laag aantal neuronen, wat ongunstig is voor NMJ-vorming. Hoewel het veel meer tijd en middelen zou kosten om een hogere dichtheid van cellen voor te bereiden (> 1 x 105/cm2),raden we aan dat de celdichtheid tussen 1,5 x 104/cm2 en 5 x 104/cm2 is met behulp van ons protocol. De NMJ gegenereerd door dit protocol is een heterogeen weefsel met meerdere celtypes die dichter bij het nabootsen van fysiologische omstandigheden. De myotubes blijken gelijkmatig te verdelen op een cultuurschotel, maar de motorneuronen verschijnen willekeurig, waarvan het fenomeen resulteert in de ongelijke verdeling van NMJ’s in een cultuur. Deze NMJ is geschikt voor kwalitatieve studies in plaats van de analyse die homogene kweeksystemen vereist. We gebruikten ook andere cellijnen, eq., H9 (ES-cellijn)18 en A11 (iPS-cellijn, niet getoonde gegevens) om NMJ te genereren door dit protocol. De NMJ kan met succes worden gegenereerd in morfologie en functie. De cultuurconditie moet echter worden geoptimaliseerd voor verschillende cellijnen.

De chemisch geactiveerde myotubes contractie en curare-afhankelijke remming bevestigd dat onze in vitro NMJ functioneel was en mogelijk kan worden toegepast voor praktische tests. Spontane spiercontracties werden willekeurig waargenomen op 3\u20124 weken cultuur, maar het kan worden vermeden door de cultuurtijd te verlengen tot twee maanden18.

Verschillende strategieën zijn gepubliceerd voor het genereren van in vitro NMJ van verschillende rijpingsstadia, maar de in vitro NMJ gegenereerd in ons systeem toonde de aanzienlijke volwassenheid, zoals we kunnen observeren de overgang van gamma naar epsilon subeenheden van AChR tijdens de cultuur18. Rijpheid is een belangrijke overweging voor ziektemodellering met in vitro NMJ21. Kortom, een in vitro NMJ met geïntegreerde structurele componenten, volwassenheid en functie is van potentieel nut voor therapeutische ontwikkeling.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Dr. Sakurai voor het vriendelijk verstrekken van 201B7MYOD. De elektronenmicroscopiestudie werd ondersteund door Keiko Okamoto-Furuta en Haruyasu Kohda (Division of Electron Microscopic Study, Center for Anatomical Studies, Graduate School of Medicine, Kyoto University). Het monoklonale antilichaam werd ontwikkeld door HHMI/Columbia University, verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank, opgericht door het National Institute Child Health and Human Development van het NIH, en onderhouden aan het Department of Biology, University of Iowa. We danken ook Shiori Oshima, Kazuhiro Nakagawa en Eriko Matsui voor bewegingsvectoranalyse. Dit werk werd ondersteund door financiering van de Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI, subsidienummers 16H05352 en 20H03642 (aan MKS); iPS Cell Research Fund (aan CYL en MKS); Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research (aan MKS); Takeda Science Foundation (aan MKS); en een subsidie van The Program for Intractable Diseases Research met behulp van ziekte-specifieke iPS cellen, die werd geholpen door het Japan Agency for Medical Research and Development (17935400 aan CYL en MKS, en 17935423 aan MKS).

Materials

Medium, growth factors and reagents Item Brand Cat. Number
2-mercaptoethanol Nacalai tesque 21418-42
B27, Gibco Gibco 12587-001
BDNF R & D Systems 248-BD
Cell detachment solution, Accumax STEMCELL Technologies #07921
Critical point dryer Hitachi ES-2030
Doxycycline Takara 631311
ECM, Matrigel (growth factor reduced) Corning 356230
GDNF R & D Systems 212-GD
Gelation, IP gel Geno Staff PG20-1
Ions coater JEOL JEC3000FC
iPSC medium, mTeSR STEMCELL Technologies 85850
KnockOut SR (KSR) Gibco 10828-028
live cell microscopy Nikon Eclipse Ti microscope
MEM-alpha Gibco 12571-071
Motion vector analysis software Sony SI8000
N2, Gibco Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103-049
NT3 R & D Systems 267-N3
Primate ES cell medium ReproCell RCHEMD001
SEM Hitachi S-4700
TEM Hitachi H7650
Y27632 Wako Chemicals GmbH 253-00513
Antibodies Brand Cat. Number Dilutions
Molecular Probes B3545 0.5 ug/ml
Islet 1 DSHB 40.2D6 1/100
Myosin heavy chain (MYH) MilliporeSigma A4.1025 1/300
Neurofilaments (NF) MilliporeSigma MAB5254 1/500
S-100 Abcam ab14849 1/300
Synaptic vesicle protein 2 (SV2) DSHB SV2 1/50
Tuj1 Covance MMS435P 1/1000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hong, I. H. K., Etherington, S. J. Neuromuscular Junction. eLS. , (2001).
  2. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
  3. Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  4. Slater, C. R. The Structure of Human Neuromuscular Junctions: Some Unanswered Molecular Questions. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2183 (2017).
  5. Comley, L. H., Nijssen, J., Frost-Nylen, J., Hedlund, E. Cross-disease comparison of amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy reveals conservation of selective vulnerability but differential neuromuscular junction pathology. Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1424-1442 (2016).
  6. Shigemoto, K., et al. Muscle weakness and neuromuscular junctions in aging and disease. Geriatrics & Gerontology International. 10, 137-147 (2010).
  7. Abicht, A., Müller, J., Lochmüller, H. Congenital Myasthenic Syndromes. GeneReviews. , (2016).
  8. Faravelli, I., et al. Motor neuron derivation from human embryonic and induced pluripotent stem cells: experimental approaches and clinical perspectives. Stem Cell Research & Therapy. 5 (4), 87-100 (2014).
  9. Demestre, M., et al. Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes. Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).
  10. Yoshida, M., et al. Modeling the early phenotype at the neuromuscular junction of spinal muscular atrophy using patient-derived iPSCs. Stem Cell Reports. 4 (4), 561-568 (2015).
  11. Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. A system for studying mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance. Development. 143 (13), 2464-2477 (2016).
  12. Uzel, S. G. M., et al. Microfluidic device for the formation of optically excitable, three-dimensional, compartmentalized motor units. Science Advances. 2 (8), 1501429 (2016).
  13. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  14. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
  15. Tanaka, A., et al. Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro. PLoS One. 8 (4), 61540 (2013).
  16. Furlan, A., Adameyko, I. Schwann cell precursor: a neural crest cell in disguise. Developmental Biology. 444, 25-35 (2018).
  17. Jessen, K. R., Mirsky, R. Schwann Cell Precursors; Multipotent Glial Cells in Embryonic Nerves. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12 (69), (2019).
  18. Lin, C. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2019).
  19. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
  20. Steinbeck, J. A., et al. Functional Connectivity under Optogenetic Control Allows Modeling of Human Neuromuscular Disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  21. Bucchia, M., Merwin, S. J., Re, D. B., Kariya, S. Limitations and Challenges in Modeling Diseases Involving Spinal Motor Neuron Degeneration in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 61 (2018).

Tags

Human Induced Pluripotent Stem CellsNeuromuscular JunctionMotor NeuronsSkeletal MuscleSchwann CellsSpinal Muscular AtrophyCell DifferentiationCell CultureCell DetachmentExtracellular MatrixDoxycyclineDifferentiation MediumMyogenic Differentiation MediumNeuromuscular Junction Medium

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lin, C., Yoshida, M., Li, L., Saito, M. K. In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (166), e61396, doi:10.3791/61396 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image