פרוטוקול משופר כדי לטהר ו מונו ישירות-Biotinylate BDNF בתוך צינור ללימודי סחר בתאי הסלולר בנוירונים
Summary
רקומביננטי BDNF המכיל רצף Avi (Bdnפאבאני) מופק בתאים HEK293 באופן חסכוני ומטוהר על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. לאחר מכן BDNFavi באופן ישיר מונו-biotinylated עם בירה אנזים בשפופרת. Bdn, ו מונו-biotinylbdni שמירה על הפעילות הביולוגית שלהם בהשוואה BDNF זמין מסחרית.
Abstract
רקומביננטי BDNF המכיל רצף Avi (Bdnפאבאני) מופק בתאי HEK293 ולאחר מכן מטוהרים ביעילות על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. פרוטוקול התפתחות פותחה כדי ישירות מונו-biotinylate אוחר Bdn, עם בירה אנזים בצינור. בתגובה זו, שומרת על הפעילות הביולוגית של מונו-ביוטיליס.
Neurotrophins הם מטרה נגזר גורמי הצמיחה לשחק תפקיד בפיתוח עצבי ותחזוקה. הם דורשים מנגנוני הובלה מהירה לאורך השביל endocytic כדי לאפשר איתות למרחקים ארוכים בין תאים עצביים שונים. התפתחות של כלים מולקולריים כדי ללמוד את הסחר של neurotrophins אפשרה מעקב מדויק של חלבונים אלה בתא באמצעות הקלטה vivo . בפרוטוקול זה פיתחנו הליך מיטבי וחסכוני לייצור BDNF מונו-biotinylated. משתנה bdnf רקומביננטי המכיל רצף avi biotinylable (bdnפאבאני) מופק בתאי HEK293 בטווח יקרוגרם ולאחר מכן מטוהרים בהליך מדרגי בקלות באמצעות כרומטוגרפיה זיקה. BDNF מטוהרים לאחר מכן יכול להיות מונו הומוגנזיס ביולוגי על ידי תגובה ישירה באמצעות מבחנה עם בירה אנזים בצינור. הפעילות הביולוגית של BDNF מונו-biotinated (mbtBDNF) יכול להיות מצומדת כדי streptavidin-מעלה מעלה לתוך fluorophores שונים. BDNFAvi ו בmbtbdnf לשמור על הפעילות הביולוגית שלהם הפגינו באמצעות זיהוי של מטרות זרחתי במורד הזרם באמצעות הכתם המערבי והפעלה של מקדם שעתוק CREB, בהתאמה. באמצעות streptavidin-הנקודות הקוואנטום, היינו מסוגלים לדמיין את הקשר באמצעות הפנמה במקביל עם ההפעלה של CREB, אשר זוהה עם נוגדן מסוים פוספהו-CREB. בנוסף, mbtBDNF מעלה מצועם streptavidin-הנקודות הקוונטיות היה מתאים לניתוח הובלה נסיגה בנוירונים בקליפת הבית הגדול בתאי מיקרופלואידיג. כך, בצינור המיוצר mbtBDNF הוא כלי אמין כדי לחקור את הדינמיקה של איתות פיזיולוגי אנדוכמה וסחר בנוירונים.
Introduction
נוירונים הם יחידות תפקודית של מערכת העצבים בעל מורפולוגיה מורכבת ומיוחדת המאפשרת תקשורת סינפטית, ולכן, הדור של התנהגות מתואמת ומורכבת בתגובה לגירויים שונים. התחזיות הנוירואליות כגון דנדריטים ואקאונים הן תכונות מבניות קריטיות המעורבות בתקשורת עצבית, ונוירוטרופלנים הם שחקנים קריטיים בקביעת המבנה והתפקוד שלהם1. Neurotrophins הם משפחה של גורמי צמיחה מופרש הכוללים NGF, NT-3, NT-4, ואת המוח נגזר neurotrophic factor (BDNF)2. במערכת העצבים המרכזית (cn), bdnf משתתפת בתהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל neurotransmission, הארבוריזציה הדנדריטי, התבגרות של השדרה הדנדריטי, פוטנציאל לטווח ארוך, בין השאר3,4. לכן, BDNF משחק תפקיד קריטי בוויסות תפקוד עצבי.
תהליכים סלולאריים שונים מווסת דינמיקה BDNF ותפקוד. על פני השטח העצבי, BDNF מאגד את הקולטן הטרופויוסין קינאז B (TrkB) ו/או קולטן נוירוטרופין p75 (p75). Bdnf-trkb ו-bdnf-p75 מתחמי הם מסודרים וממוינותבתוךמערכות endocytic שונים 5,6,7,8. תקן סחר תאיים של מתחם bdnf/trkb נדרש עבור איתות bdnf נאות במעגלים עצביים שונים9,10,11. מסיבה זו, הבנה עמוקה של הדינמיקה הסחר BDNF ושינויים שנמצאו בתהליכים pathפסלוגיים הוא חיוני כדי להבין את האיתות BDNF בריאות ומחלות. התפתחות הרומן והכלים המולקולריים הספציפיים לניטור תהליך זה יסייעו לנהוג בשדה זה קדימה ולאפשר תפיסה טובה יותר של מנגנוני הרגולציה המעורבים.
ישנם מספר כלים זמינים למחקר של סחר BDNF בנוירונים. מתודולוגיה בשימוש נפוץ כוללת את הרקומביננטי bdnf מתויג עם מולקולות פלורסנט כגון חלבון פלורסנט ירוק (gfp) או הווריאציה monomeric אדום העביר המשתנה של gfp mcherry12,13. עם זאת, קיצור מרכזי של ביטוי overdnf הוא שזה מבטל את האפשרות של אספקת ריכוזים ידועים של נוירוטרופין זה. כמו כן, זה עלול לגרום רעילות הסלולר, מטשטש את הפרשנות של תוצאות14. אסטרטגיה חלופית היא העברה של מעבר החצייה של TrkB מתויג, כגון דגל-TrkB. מתודולוגיה זו מאפשרת ללמוד את הדינמיקה של TrkB הפנמה15, אבל זה כולל גם העברה, אשר עשוי לגרום לתפקוד שונה trkb ורעילות הסלולר. כדי להתגבר על מכשולים מתודולוגיים אלה, רקומביננטי משתנים של ngf ו bdnf המכיל רצף Avi (bdnפאבאני), אשר יכול להיות מונו-biotinated על ידי ביוטין-ligase אנזימים בירה, פותחו16,17. Biotinylated רקומביננטי BDNF יכול להיות מצמידים כלים שונים מאוגד streptavidin, אשר כוללים fluorophores, חרוזים, חלקיקים פאראמגנטים בין היתר לאיתור. מבחינת הדמיה של תא חי, נקודות הקוונטים (QD) הפכו לעתים קרובות fluorophores, כפי שהם מאפיינים רצוי עבור מעקב יחיד חלקיק, כגון בהירות מוגברת ועמידות הלבנת כאשר לעומת מולקולה קטנה fluorophores18.
הייצור של מונו-biotinylated BDNF (mbtBDNF) באמצעות Bdnפאבאני הושגה על ידי העברת שיתוף של פלמידים הנהיגה ביטוי של Bdnפאבאני ובירה, ואחריו טיהור של חלבון רקומביננטי על ידי כרומטוגרפיה של אהדה עם תשואה של 1-2 μg של BDNF ל 20 מ ‘ של מדיה תרבותית ממוזגת17. כאן, אנו מציעים שינוי של פרוטוקול זה המאפשר את טיהור BDNFAvi מ 500 mL של מדיה ממוזג, אשר מבקש למקסם את ההתאוששות מחלבון בפרוטוקול מבוסס טור כרומטוגרפיה על קלות מניפולציה. הסוכן המשמש לזיהום, פוליאתילן, מבטיח שיטה חסכונית מבלי להקריב את התשואה החוצה. הצעד מונו-ביולציה הותאם לתגובת חוץ גופית כדי למנוע את הסיבוכים הקשורים בשיתוף פעולה ולהבטיח תוויות הומוגנית של BDNF. הפעילות הביולוגית של mbtbdnf הוכח על ידי כתמי המערבי וניסויים מיקרוסקופ פלואורסצנטית, כולל הפעלת pcreb ולחיות הדמיה תא ללמוד הובלה סיבי הנסיגה של bdnf בתאי microfluidic. השימוש בפרוטוקול זה מאפשר מיטוב, ייצור תשואה גבוהה של מונו הומוגנית-biotinylated ו פעילים ביולוגית BDNF.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, מתודולוגיה ממוטבת לייצור וטיהור של mbtBDNF בהליך מבוסס כרומטוגרפיה הזיקה מתוארת, בהתבסס על עבודתם של סונג ומשתפי פעולה17. המיטובים כוללים את השימוש במיגיב התרגום החסכוני (פיי) תוך שמירה על יעילות של שיטות מעבר יקרות יותר כגון lipofectamine. מיטוב זה מיתרגם הפחתת עלות משמעותית ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים בהכרת תודה התמיכה הפיננסית של Fondecyt (1171137) (FCB), מרכז בסיס של מצוינות במדע וטכנולוגיה (AFB 170005) (FCB), מילניום-גרעין (P07/011-F) (FCB), פרס החוקר הבכיר לאמון (107116/Z/15/Z) (GS) ו בבריטניה מחקר דמנציה פרס קרן (GS). העבודה הזאת נתמכת על ידי Unidad דה מיקרוצאדה Avanzada UC (UMA UC).
Materials
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Sucrose | Merck | 107687 | |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
- Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
- Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
- Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A., Lewin, G., Carter, B. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. 220, (2014).
- Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
- Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
- Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
- Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, 11-14 (2007).
- Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
- Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
- Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
- Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
- Biocompare: The Buyer’s Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012)
- Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
- Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
- Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
- Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
- Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
- Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
- Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
- . The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019)
- Mowla, , et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
- Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
- Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L’Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
- Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
- Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
- Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).
