Un protocole amélioré pour purifier et directement mono-biotinylate recombinant BDNF dans un tube pour les études de trafic cellulaire dans les neurones
Summary
Le BDNF recombinant contenant une séquence Avi (BDNFAvi) est produit dans les cellules HEK293 d’une manière rentable et est purifié par la chromatographie d’affinité. BDNFavi est alors directement mono-biotinylé avec l’enzyme BirA dans un tube. BDNFavi et BDNFavi mono-biotinylés conservent leur activité biologique par rapport au BDNF disponible dans le commerce.
Abstract
Le BDNF recombinant contenant une séquence Avi (BDNFAvi) est produit dans des cellules HEK293, puis purifié de manière rentable par chromatographie d’affinité. Un protocole reproductible a été développé pour mono-biotinylate directement BDNFAvi avec l’enzyme BirA dans un tube. Dans cette réaction, le BDNFAvi mono-biotinylé conserve son activité biologique.
Les neurotrophines sont des facteurs de croissance dérivés de la cible qui jouent un rôle dans le développement et l’entretien des neurones. Ils nécessitent des mécanismes de transport rapide le long de la voie endocytique pour permettre la signalisation longue distance entre les différents compartiments neuronaux. Le développement d’outils moléculaires pour étudier le trafic de neurotrophines a permis le suivi précis de ces protéines dans la cellule à l’aide de l’enregistrement in vivo. Dans ce protocole, nous avons développé une procédure optimisée et rentable pour la production de BDNF mono-biotinylée. Une variante recombinante de BDNF contenant une séquence d’avi biotinylable (BDNFAvi) est produite dans les cellules HEK293 dans la gamme de microgrammes, puis purifiée dans une procédure facilement évolutive utilisant la chromatographie d’affinité. Le BDNF purifié peut alors être homogènement mono-biotinylé par une réaction in vitro directe avec l’enzyme BirA dans un tube. L’activité biologique du BDNF mono-biotinylé (mbtBDNF) peut être conjuguée à la streptavidine-conjuguée à différents fluorophores. BDNFAvi et mbtBDNF conservent leur activité biologique démontrée par la détection de cibles phosphorylyées en aval à l’aide de la tache occidentale et de l’activation du facteur de transcription CREB, respectivement. En utilisant des points streptavidine-quantiques, nous avons pu visualiser l’internalisation mbtBDNF concomitante à l’activation du CREB, qui a été détecté avec un anticorps spécifique au phospho-CREB. En outre, mbtBDNF conjugué aux points streptavidin-quantum était approprié pour l’analyse rétrograde de transport dans les neurones corticaux cultivés dans les chambres microfluidiques. Ainsi, dans le tube produit mbtBDNF est un outil fiable pour étudier la dynamique de signalisation physiologique endosome et le trafic dans les neurones.
Introduction
Les neurones sont les unités fonctionnelles du système nerveux possédant une morphologie complexe et spécialisée qui permet la communication synaptique, et donc, la génération de comportements coordonnés et complexes en réponse à divers stimuli. Les projections neuronales telles que les dendrites et les axones sont des caractéristiques structurelles essentielles impliquées dans la communication neuronale, et les neurotrophines sont des acteurs essentiels pour déterminer leur morphologie et leur fonction1. Les neurotrophines sont une famille de facteurs de croissance sécrétés qui incluent NGF, NT-3, NT-4, et le facteur neurotrophique cerveau-dérivé (BDNF)2. Dans le système nerveux central (SNC), BDNF participe à divers processus biologiques, y compris la neurotransmission, l’arborisation dendritique, la maturation des épines dendritiques, la potentialisation à long terme, entre autres3,4. Par conséquent, BDNF joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction neuronale.
Divers processus cellulaires régulent la dynamique et la fonction de BDNF. Sur la surface neuronale, le BDNF lie le récepteur de la tropomyosine kinase B (TrkB) et/ou le récepteur de la neurotrophine p75 (p75). Les complexes BDNF-TrkB et BDNF-p75 sont endocytosés et triés dans différentes organites endocytiques5,6,7,8. Le trafic intracellulaire correct du complexe BDNF/TrkB est nécessaire pour la signalisation BDNF appropriée dans différents circuits neuronaux9,10,11. Pour cette raison, une compréhension profonde de la dynamique du trafic BDNF et de ses altérations trouvées dans les processus pathophysiologiques est essentielle pour comprendre la signalisation BDNF dans la santé et la maladie. La mise au point d’outils moléculaires nouveaux et spécifiques pour surveiller ce processus aidera à faire avancer ce domaine et permettra de mieux comprendre les mécanismes de réglementation impliqués.
Il existe plusieurs outils disponibles pour l’étude du trafic BDNF dans les neurones. Une méthodologie couramment utilisée implique la transfection du BDNF recombinant marqué avec des molécules fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP) ou la variante monomérique fluorescente de GFP mCherry12,13. Cependant, une lacune majeure de la surexpression BDNF est qu’elle élimine la possibilité de fournir des concentrations connues de cette neurotrophine. En outre, il peut entraîner la toxicité cellulaire, obscurcissant l’interprétation des résultats14. Une stratégie alternative est la transfection d’un TrkB marqué par épitope, tel que Flag-TrkB. Cette méthodologie permet l’étude de la dynamique d’internalisation TrkB15, mais elle implique également la transfection, qui pourrait entraîner une altération de la fonction TrkB et la toxicité cellulaire. Pour surmonter ces obstacles méthodologiques, des variantes recombinantes de NGF et bdnf contenant une séquence Avi (BDNFAvi), qui peuvent être mono-biotinylées par l’enzyme biotin-ligase BirA, ont été développées16,17. Le BDNF recombinant biotinylé peut être couplé à différents outils liés à la streptavidine, qui comprennent des fluorophores, des perles, des nanoparticules paramagnétiques, entre autres, pour la détection. En termes d’imagerie des cellules vivantes, les points quantiques (QD) sont devenus fréquemment utilisés fluorophores, car ils ont des caractéristiques souhaitables pour le suivi des particules uniques, tels que la luminosité accrue et la résistance au photobleaching par rapport aux fluorophores de petites molécules18.
La production de BDNF mono-biotinylée (mbtBDNF) à l’aide de BDNFAvi a été réalisée par co-transfection de plasmides conduisant à l’expression de BDNFAvi et BirA, suivie par la purification de la protéine recombinante par chromatographie d’affinité avec un rendement de 1-2 μg de BDNF par 20 mL de 20 mL de milieux de culture17HEK293-conditionnés . Ici, nous proposons une modification de ce protocole qui permet la purification BDNFAvi à partir de 500 mL de supports conditionnés HEK293, qui vise à maximiser la récupération des protéines dans un protocole basé sur la chromatographie-colonne pour faciliter la manipulation. L’agent de transfection utilisé, la polyéthylèneimine (Î.-P.-É.), assure une méthode rentable sans sacrifier le rendement de la transfection. L’étape mono-biotinylation a été adaptée à une réaction in vitro afin d’éviter les complications associées aux co-transfections et d’assurer l’étiquetage homogène du BDNF. L’activité biologique du mbtBDNF a été démontrée par des expériences occidentales de microscopie de tache et de fluorescence, y compris l’activation du PCREB et de l’imagerie cellulaire vivante pour étudier le transport axonal rétrograde du BDNF dans les chambres microfluidiques. L’utilisation de ce protocole permet une production optimisée et à haut rendement de BDNF mono-biotinylée homogène et biologiquement active.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, une méthodologie optimisée pour la production et la purification du mbtBDNF dans une procédure basée sur la chromatographie d’affinité est décrite, basée sur le travail de Sung et collaborateurs17. Les optimisations comprennent l’utilisation d’un réactif transfection rentable (Î.-P.-É.) tout en maintenant l’efficacité de méthodes de transfection plus coûteuses comme la lipofectamine. Cette optimisation se traduit par une réduction significative des coûts du…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent avec gratitude le soutien financier de Fondecyt (1171137) (FCB), du Centre basal d’excellence en science et technologie (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), le Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) et un prix de la Uk Dementia Research Institute Foundation (GS). Ce travail a été soutenu par l’Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).
Materials
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Sucrose | Merck | 107687 | |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
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