Un protocolo mejorado para purificar y directamente monobiocalinato recombinante BDNF en un tubo para estudios de tráfico celular en neuronas

Las neuronas son las unidades funcionales del sistema nervioso que poseen una morfología compleja y especializada que permite la comunicación sináptica, y por lo tanto, la generación de comportamiento coordinado y complejo en respuesta a diversos estímulos. Las proyecciones neuronales como las dendritas y los axones son características estructurales críticas implicadas en la comunicación neuronal, y las neurotrofinas son actores cruciales para determinar su morfología y función^1. Las neurotrofinas son una familia de factores de crecimiento secretados que incluyen NGF, NT-3, NT-4 y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)². En el sistema nervioso central (CNS), BDNF participa en diversos procesos biológicos incluyendo neurotransmisión, arborización dendrítica, maduración de espinas dendríticas, potenciación a largo plazo, entre otros^3,,4. Por lo tanto, BDNF desempeña un papel crítico en la regulación de la función neuronal.

Diversos procesos celulares regulan la dinámica y la función de BDNF. En la superficie neuronal, BDNF une la quinasa del receptor de tropomiosina B (TrkB) y/o el receptor de neurotrofina p75 (p75). Los complejos BDNF-TrkB y BDNF-p75 están endocytosed y ordenados en diferentes orgánulos endocíticos^5,6,7,8. Se requiere un tráfico intracelular correcto del complejo BDNF/TrkB para la señalización adecuada de BDNF en diferentes circuitos neuronales^9,10,11. Por esta razón, una comprensión profunda de la dinámica de tráfico de BDNF y sus alteraciones encontradas en los procesos fisiopatológicos es esencial para entender la señalización de BDNF en la salud y la enfermedad. El desarrollo de herramientas moleculares novedosas y específicas para monitorear este proceso ayudará a impulsar este campo y permitirá una mejor comprensión de los mecanismos regulatorios involucrados.

Hay varias herramientas disponibles para el estudio del tráfico de BDNF en las neuronas. Una metodología de uso común implica la transfección de BDNF recombinante etiquetado con moléculas fluorescentes como la proteína fluorescente verde (GFP) o la variante monomérica fluorescente desplazada en rojo de GFP mCherry^12,13. Sin embargo, una deficiencia importante de la sobreexpresión de BDNF es que elimina la posibilidad de entregar concentraciones conocidas de esta neurotrofina. También, puede resultar en toxicidad celular, oscureciendo la interpretación de los resultados¹⁴. Una estrategia alternativa es la transfección de un TrkB con etiqueta de epítopo, como Flag-TrkB. Esta metodología permite el estudio de la dinámica de internalización TrkB^15,pero también implica transfección, que podría resultar en la alteración de la función TrkB y toxicidad celular. Para superar estos obstáculos metodológicos, se desarrollaron variantes recombinantes de NGF y BDNF que contienen una secuencia Avi (BDNFAvi), que pueden ser monobiocrizadas por la enzima biotina-ligasa BirA,^16,17. El BDNF recombinante biotinilado se puede acoplar a diferentes herramientas unidas a estreptavidina, que incluyen fluoróforos, perlas, nanopartículas paramagnéticas entre otras para su detección. En términos de imágenes de células vivas, los puntos cuánticos (QD) se han convertido en fluoróforos de uso frecuente, ya que tienen características deseables para el seguimiento de una sola partícula, como el aumento del brillo y la resistencia al fotoblanqueo en comparación con los fluoróforos de moléculas pequeñas¹⁸.

La producción de BDNF monobiocrílico (mbtBDNF) utilizando BDNFAvi se ha logrado mediante la co-transfección de plásmidos que impulsan la expresión de BDNFAvi y BirA, seguida de la purificación de la proteína recombinante por¹⁷cromatografía de afinidad con un rendimiento de 1-2 g de BDNF por 20 mL de HEK293- Aquí, proponemos una modificación de este protocolo que permite la purificación DE BDNFAvi a partir de 500 ml de medios condicionados por HEK293, que busca maximizar la recuperación de proteínas en un protocolo basado en cromatografía-columna para facilitar la manipulación. El agente de transfección utilizado, la polietilenimina (PEI), garantiza un método rentable sin sacrificar el rendimiento de la transfección. La etapa de monobiocriilación se ha adaptado a una reacción in vitro para evitar las complicaciones asociadas con las co-transfecciones y para garantizar un etiquetado homogéneo de BDNF. La actividad biológica del mbtBDNF fue demostrada por experimentos de microscopía de borla occidental y fluorescencia, incluyendo la activación de pCREB y la imagen de células vivas para estudiar el transporte axonal retrógrado de BDNF en cámaras microfluídicas. El uso de este protocolo permite una producción optimizada y de alto rendimiento de BDNF homogénea monobionitilada y biológicamente activa.