Un protocollo migliorato per purificare e direttamente mono-biotinyare recombinante BDNF in un tubo per gli studi sul traffico cellulare nei neuroni

I neuroni sono le unità funzionali del sistema nervoso in possesso di una morfologia complessa e specializzata che consente la comunicazione sinaptica, e quindi la generazione di un comportamento coordinato e complesso in risposta a diversi stimoli. Proiezioni neuronali come dendriti e assoni sono caratteristiche strutturali critiche coinvolte nella comunicazione neuronale, e le neurotrofie sono fattori cruciali per determinare la loro morfologia e funzione¹. Le neurotrofie sono una famiglia di fattori di crescita secreti che includono NGF, NT-3, NT-4 e fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)². Nel sistema nervoso centrale (CNS), BDNF partecipa a diversi processi biologici tra cui neurotrasmissione, arborizzazione dendritica, maturazione delle spine dendritiche, potenziamento a lungo termine, tra gli altri^3,4. Pertanto, BDNF svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione neuronale.

Diversi processi cellulari regolano le dinamiche e le funzioni del BDNF. Sulla superficie neuronale, BDNF lega il recettore tropomiosina chinasi B (TrkB) e/o il recettore neurotrofiina p75 (p75). I complessi BDNF-TrkB e BDNF-p75 sono endocitosi e ordinati in diversi organelli endocitici^5,6^,77,8. Il corretto traffico intracellulare del complesso BDNF/TrkB è necessario per una corretta segnalazione BDNF in circuiti neuronali diversi^9,10,11. Per questo motivo, una profonda comprensione delle dinamiche del traffico BDNF e delle sue alterazioni nei processi patofisiologici è essenziale per comprendere la segnalazione BDNF in salute e malattia. Lo sviluppo di nuovi e specifici strumenti molecolari per monitorare questo processo contribuirà a portare avanti questo campo e permetterà una migliore comprensione dei meccanismi normativi coinvolti.

Ci sono diversi strumenti disponibili per lo studio del traffico di BDNF nei neuroni. Una metodologia comunemente usata prevede la trasfezione di BDNF ricombinante etichettato con molecole fluorescenti come la proteina fluorescente verde (GFP) o la variante fluorescente fluorescente monomerica di GFP mCherry^12,13. Tuttavia, una grave carenza di sovraespressione BDNF è che elimina la possibilità di fornire concentrazioni note di questa neurotrofia. Inoltre, può provocare tossicità cellulare, oscurando l’interpretazione dei risultati¹⁴. Una strategia alternativa è la trasfezione di un TrkB con etichetta epitope, come Flag-TrkB. Questa metodologia consente lo studio delle dinamiche di internalizzazione TrkB¹⁵, ma comporta anche la trasfezione, che potrebbe provocare alterata funzione TrkB e tossicità cellulare. Per superare questi ostacoli metodologici, sono state sviluppate varianti ricombinanti di NGF e BDNF contenenti una sequenza Avi (BDNFAvi), che può essere monobiota dall’enzima biotina-ligase BirA, sono state sviluppate^16,17. Il BDNF ricombinante biotinylato può essere accoppiato a diversi strumenti legati alla streptavidina, che includono fluorofori, perline, nanoparticelle paramagnetiche tra gli altri per il rilevamento. In termini di imaging a cellule vive, i punti quantici (QD) sono diventati fluorofori usati di frequente, in quanto hanno caratteristiche desiderabili per il tracciamento di singole particelle, come una maggiore luminosità e resistenza al fotobleaching rispetto ai piccoli fluorofori molecolari¹⁸.

La produzione di BDNF monobiotinylata (mbtBDNF) utilizzando BDNFAvi è stata ottenuta mediante co-trasfezione di plasmidi guidando l’espressione di BDNFAvi e BirA, seguito dalla purificazione della proteina ricombinante mediante cromatografia di affinità con una resa di 1-2 g di BDNF per 20 mL di supporti di coltura con condizioni HEK293¹⁷. Qui, proponiamo una modifica di questo protocollo che consente la purificazione BDNFAvi da 500 mL di supporti con condizione HEK293, che cerca di massimizzare il recupero delle proteine in un protocollo basato su colonna cromatografia per facilità di manipolazione. L’agente di trasfezione usato, la polietileneimina (PEI), garantisce un metodo conveniente senza sacrificare la resa della trasfezione. La fase di monobiozione è stata adattata a una reazione in vitro per evitare le complicazioni associate alla co-transfections e per garantire un’etichettatura omogenea del BDNF. L’attività biologica del mbtBDNF è stata dimostrata da esperimenti di microscopia a macchia e fluorescenza occidentali, tra cui l’attivazione del pCREB e l’imaging a cellule vive per studiare il trasporto assonale retrogrado del BDNF in camere microfluidiche. L’uso di questo protocollo consente una produzione ottimizzata e ad alto rendimento di BDNF omogeneo monobio-biobiolato e biologicamente attivo.