ニューロンの細胞密売研究のためのチューブ内の組換えBDNFを精製し、直接モノビオチン化するための改良されたプロトコル

ニューロンは、シナプスコミュニケーションを可能にする複雑で特殊な形態を有する神経系の機能的単位であり、したがって、多様な刺激に応答して協調的で複雑な行動の生成である。樹状突起や軸索などの神経突起は、神経伝達に関与する重要な構造的特徴であり、ニューロトロフィンは形態と機能1を決定する上で重要な役割を^果たします。ニューロトロフィンは、NGF、NT-3、NT-4、および脳由来神経栄養因子(BDNF)2を含む分泌成長因子のファミリーである。²中枢神経系(CNS)において、BDNFは神経伝達、樹状樹状の樹状化、樹状脊椎の成熟、長期増強^、3,44を含む多様な生物学的^{プロセスに関与}する。したがって、BDNFは神経機能の調節において重要な役割を果たす。

多様な細胞プロセスは、BDNFのダイナミクスと機能を調節します。神経細胞表面では、BDNFはトロポミオシン受容体キナーゼB(TrkB)および/またはp75ニューロトロフィン受容体(p75)に結合する。BDNF-TrkBおよびBDNF-p75複合体は、エンドサイトース化され、異なるエンドサイトオルガネラ^{55、6、7、86,7,8}に分類される。BDNF/TrkB複合体の正しい細胞内の人身売買は、異なる神経回路^{9、10、1110}における適切⁹なBDNFシグナル伝達のために必要^と11される。このため、BDNFの人身売買ダイナミクスと病態生理学的プロセスにおけるその変化を深く理解することは、健康と疾患におけるBDNFシグナル伝達を理解するために不可欠である。このプロセスを監視する新しい特定の分子ツールの開発は、この分野を前進させ、関係する規制メカニズムをよりよく把握するのに役立ちます。

ニューロンの BDNF 人身売買の研究に利用できるいくつかのツールがあります。.一般的に使用される方法論は、GFP mCherry^12,13の緑色蛍光タンパク質(GFP)または単量体蛍光赤シフト変異型などの蛍光分子でタグ付けされた組換えBDNFのトランスフェクション^を13含む。しかし、BDNF過剰発現の主な欠点は、このニューロトロフィンの既知の濃度を提供する可能性を排除することです。また、細胞毒性をもたらし、結果¹⁴の解釈を隠す。別の戦略は、Flag-TrkBのようなエピトープタグ付きTrkBのトランスフェクションです。この方法論はTrkBの内在性ダイナミクス¹⁵の研究を可能にするが、それはまた、TrkB機能および細胞毒性の変化をもたらす可能性があるトランスフェクションを伴う。これらの方法論的ハードルを克服するために、ビオチンリガーゼ酵素BirAによって単一ビオチン化することができるアビ配列(BDNFAvi)を含むNGFおよびBDNFの組換え変異体が^16,17,17に開発された。ビオチン化組換えBDNFは、フルオロフォア、ビーズ、常磁性ナノ粒子などを検出するための異なるストレプトアビジン結合ツールに結合することができる。ライブセルイメージングの面では、量子ドット(QD)は、小分子フルオロフォア¹⁸と比較した場合の光漂白に対する輝度および耐性の増加などの単粒子追跡に望ましい特性を有するため、頻繁に使用されるようになっている。

BDNFAviを用いたモノビオチン化BDNF(mbtBDNF)の生産は、BDNFAviとBirAの発現を駆動するプラスミドの共トランスフェクションによって達成され、続いて、10mLあたりBDNFの収率1〜2μgのBDNFの収率を有するアフィニティークロマトグラフィーによる組換えタンパク質の精製が行^われた。ここでは、500 mLのHEK293コンディションメディアからのBDNFAvi精製を可能にするこのプロトコルの改変を提案し、操作を容易にするためのクロマトグラフィーカラムベースのプロトコルでタンパク質回収を最大化することを目指す。使用されたトランスフェクション剤、ポリエチレンイミン(PEI)は、トランスフェクション収率を犠牲にすることなく費用対効果の高い方法を保証する。モノビオチン化ステップは、共トランスフェクションに関連する合併症を回避し、BDNFの均質な標識を確実にするために、インビトロ反応に適応されています。mbtBDNFの生物活性は、微小流体室におけるBDNFの逆行軸索輸送を研究するためのpCREBおよび生細胞イメージングの活性化を含む、ウェスタンブロットおよび蛍光顕微鏡実験によって実証された。このプロトコルを使用すると、均質なモノビオチン化および生物学的に活性なBDNFの最適化された高収率生産が可能になります。