Ein verbessertes Protokoll zur Reinigung und direkt Mono-Biotinylat Rekombinanten BDNF in einer Tube für Zelllandhandel Studien in Neuronen

Neuronen sind die funktionellen Einheiten des Nervensystems, die über eine komplexe und spezialisierte Morphologie verfügen, die synaptische Kommunikation und damit die Erzeugung von koordiniertem und komplexem Verhalten als Reaktion auf verschiedene Reize ermöglicht. Neuronale Projektionen wie Dendriten und Axone sind kritische strukturelle Merkmale, die in der neuronalen Kommunikation beteiligt sind, und Neurotrophine sind entscheidende Akteure bei der Bestimmung ihrer Morphologie und Funktion¹. Neurotrophine sind eine Familie von sezernierten Wachstumsfaktoren, die NGF, NT-3, NT-4 und Gehirn-abgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF)²umfassen. Im Zentralnervensystem (ZNS) beteiligt sich BDNF an verschiedenen biologischen Prozessen wie Neurotransmission, dendritische Arborisierung, Reifung der dendritischen Stacheln, Langzeitpotenzierung, unter anderem^3,4. Daher spielt BDNF eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der neuronalen Funktion.

Verschiedene zelluläre Prozesse regulieren die Dynamik und Funktion des BDNF. Auf der neuronalen Oberfläche bindet BDNF die Tropomyosin-Rezeptorkinase B (TrkB) und/oder den p75-Neurotrophinrezeptor (p75). BDNF-TrkB und BDNF-p75 Komplexe sind endocytosed und sortiert in verschiedenen endozytischen Organellen^5,6,7,8. Korrekter intrazellulärer Handel des BDNF/TrkB-Komplexes ist für die korrekte BDNF-Signalisierung in verschiedenen neuronalen Schaltkreisen^9,10,11erforderlich. Aus diesem Grund ist ein tiefes Verständnis der BDNF-Handelsdynamik und ihrer Veränderungen in pathophysiologischen Prozessen unerlässlich, um BDNF-Signale in Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Die Entwicklung neuer und spezifischer molekularer Instrumente zur Überwachung dieses Prozesses wird dazu beitragen, diesen Bereich voranzubringen und ein besseres Verständnis der beteiligten Regulierungsmechanismen zu ermöglichen.

Es gibt mehrere Werkzeuge für die Studie des BDNF-Handels mit Neuronen. Eine häufig verwendete Methodik beinhaltet die Transfektion von rekombinantem BDNF, das mit fluoreszierenden Molekülen wie grünem fluoreszierendem Protein (GFP) oder der monomeren fluoreszierenden rot verschiebbaren Variante von GFP mCherry^12,13getaggt ist. Jedoch, ein großes Manko der BDNF Überexpression ist, dass es die Möglichkeit der Bereitstellung bekannter Konzentrationen dieses Neurotrophin eliminiert. Auch, Es kann zu zellulären Toxizität führen, verdecken die Interpretation der Ergebnisse¹⁴. Eine alternative Strategie ist die Transfektion eines mit Epitopen markierten TrkB, wie Flag-TrkB. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der TrkB Internalisierungsdynamik¹⁵, aber es beinhaltet auch Transfektion, die zu veränderten TrkB-Funktion und zellulärer Toxizität führen könnte. Um diese methodischen Hürden zu überwinden, wurden rekombinante Varianten von NGF und BDNF mit einer Avi-Sequenz (BDNFAvi), die durch das Biotinligase-Enzym BirA monobiotinyliert werden kann,^{entwickelt 16,17}. Biotinyliertes rekombinantes BDNF kann mit verschiedenen Streptavidin-gebundenen Werkzeugen gekoppelt werden, darunter Fluorophore, Perlen, paramagnetische Nanopartikel, unter anderem zum Nachweis. In Bezug auf die Live-Zell-Bildgebung sind Quantenpunkte (QD) häufig verwendete Fluorophore geworden, da sie wünschenswerte Eigenschaften für die Verfolgung von Einzelpartikeln haben, wie erhöhte Helligkeit und Beständigkeit gegen Photobleichungen im Vergleich zu kleinen Molekülfluorophoren¹⁸.

Die Produktion von monobiotinyliertem BDNF (mbtBDNF) mit BDNFAvi wurde durch ko-Transfektion von Plasmiden erreicht, die die Expression von BDNFAvi und BirA antreiben, gefolgt von der Reinigung des rekombinanten Proteins durch Affinitätschromatographie mit einer Ausbeute von 1-2 g BDNF pro 20 ml HEK293-konditionierte Kulturmedien¹⁷. Hier schlagen wir eine Änderung dieses Protokolls vor, die eine BDNFAvi-Reinigung von 500 ml HEK293-konditionierten Medien ermöglicht, die darauf abzielt, die Proteinrückgewinnung in einem chromatographie-spaltenbasierten Protokoll zu maximieren, um die Manipulation zu erleichtern. Das verwendete Transfektionsmittel Polyethylenimimin (PEI) sorgt für ein kostengünstiges Verfahren ohne Einbußen bei der Transfektionsausbeute. Der Monobiotinylisierungsschritt wurde an eine In-vitro-Reaktion angepasst, um die Mittransfektionen zu vermeiden und eine homogene Kennzeichnung von BDNF zu gewährleisten. Die biologische Aktivität des mbtBDNF wurde durch western blot und fluorescence mikroskopische Experimente demonstriert, einschließlich der Aktivierung von pCREB und Live-Zell-Bildgebung, um retrograde axonale Transport von BDNF in mikrofluidischen Kammern zu untersuchen. Die Verwendung dieses Protokolls ermöglicht eine optimierte, ertragreiche Produktion homogener monobiotinylierter und biologisch aktiver BDNF.